201100. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy tisztaságú, csökkentett endotoxintartalmú, javított terápiás értékű humán leukocita alfa-interferon előállítására üzemi méretekben
3 HU 201100 B 4 szitmény fajlagos aktivitása mintegy 1- -5xl07 IU/mg fehérje (vő. a Cantell-módszer szerinti 2xl06 IU/mg fehérje értékkel);- a termék a biológiailag aktív altípusok minél szélesebb spektrumával rendelkezzék, beleértve a savlabilis komponenseket is;- az eljárás üzemi méretben gazdaságosan alkalmazható legyen. Találmányunk tárgya magas titerű nyers oC-IFN előállítása és ennek tisztítása controlled pore glass kromatográfia, etilalkoholos frakcionálás és membrántechnika kombinációjával. Az eljárás egyes lépései együttesen biztosítják a termék (oC-IFN) előnyös tulajdonságait, ezért módszerünk az önmagában ismert műveleti lépések előnyös, új kombinációját valósítja meg. Eljárásunk során a humán vérből származó fehérsejteket a szennyező vörösvértestektöl ammóniumkloridos hemolízissel tisztítjuk meg. Előnyösen járhatunk el úgy, ha a hemolizist 0-5 °C hőmérsékletű pH=7,2-7,4 értékre pufferolt 0,83%-os ammóniumklorid-oldattal végezzük két lépésben. Az első lépésben a sejtszuszpenzió/ammóniumklorid arány 1:3, a második lépésben 1:9. A hemolizáló közegből a fehérvérsejteket 1000-2000 -vei történő centrifugálással ülepítjük ki. Az így nyert fehérvérsejt-szuszpenziót alkalmas tápoldatban szuszpendáljuk. Ilyen alkalmas tápoldatok a szakember számára jólismert módon azok az élettanilag szükséges sókat, aminosavakat és vitaminokat tartalmazó, közvetlenül felhasználható, pl. liofilizált tápoldatkészítmények, amelyeknek gyári jelzése pl. .Eagle MEM" (Serva), .RPMI" vagy a magyar szakirodalomból (Béládi Ilona és munkatársai; 182.209 lajstromszámú magyar szabadalom) ismert .MSKD' jelű tápoldat. A szuszpenzió koncentrációja 1-I,3xl07 sejt/ml. A tápoldat 0,5-2,5 mg/ml gammaglobulin-mentes humán szérumot is tartalmaz. Előkezelés (priming) céljából 37 °C-on 100-200 IU/ml humán oC-IFN-nal inkubáljuk a sejtkultúrát 1,5-3 órán keresztül. Ezt követően 100-200 hemagglutinéciós (HA) egység/ml Sendai-vírussal indukáljuk az oC-IFN termelést. A fehérvérsejteket centrifugálással választjuk el a tápoldattól; s a termék a nyers oC-IFN. A nyers oC-IFN-t a lebegő szennyezésektől, sejttörmelékektöl membránszűréssel tisztítjuk meg, majd CPG 10/75 töltetet tartalmazó oszlopon nyomjuk keresztül. A töltetet előbb PBS-sel átmossuk. Az oC-IFN-t 0,05-0,1 mól Tris.HCl + 1,5 mól NaCl-t tartalmazó 8,0 pH-jú oldattal eluáljuk. Az oC-IFN tartalmú eluátumot -20 °C-on 55-75%-ob vizes etanollal frakcionálva tisztítjuk. A kicsapódott szennyező fehérjéket centrifugálással távolítjuk el. Az etanolos, oC-IFN tartalmú felülúszót ultraszűrővel a fordított ozmózis elve alapján 10-20-szorosára tőményitjük, majd az etanolt diafiltrálással vagy dialízissel alkalmas pufféra cseréljük le. (Alkalmas pufferként utalunk az előzőekben példaképpen megemlített pufferokra.) Eljárhatunk úgy is, hogy az cC-IFN-t az etanolos felülúszóból CPG-kromatográfia segítségével ismét adszorbeáltatjuk. Az Így nyert nagy tisztaságú oC-IFN oldat közvetlenül liofilezhető. A vírusmentességet mind a CPG-kromatográfia, mind az 55-75 tf%-os etilalkoholos kezelés önmagában biztosítja. Az esetlegesen előforduló endotoxin is az alkoholos kezelésnél távolítható el, mivel az endotoxin a csapadékba kerül. Minthogy az eljárás nem tartalmaz alacsony pH-n végrehajtott lépést, a savlabilis oC-IFN-altipusok sem veszítenek aktivitásukból. 1. példa Humán vérből származó fehérvérsejtben dús vérfrakciót (buffy coat-ot) jeges hűtés mellett 10 percen keresztül háromszoros mennyiségű, 0- +4 °C-os, 0,83 tömeg%-os, pH=7,3-ra pufferolt ammóniumklorid-oldattal keverünk össze. A fehérvérsejtek kiülepitése céljából 10 perc elteltével +4 °C-on 1500 g-val centrifugálást végzünk. A fehérvérsejteket ezután PBS-(=phosphate buffered saline (-oldatban szuszpendáljuk és a sejtszuszpenzió kilencszeresét kitevő térfogatú, 0 - -+4 °C-os, 0,83%-os ammóniumklorid-oldattal ismételten kezeljük. A PBS-oldat összetétele az alábbi: oldott anyag koncentráció [mg/1] NaCl 8800 KC1 220 Na2HP04.12H20 3500 NaH2P04.H2Ü 224 A PBS-oldat pH-ja: 7,2-7,4. Tíz perc elteltével az előbbivel azonos módon centrifugálással kiülepitjük a sejteket, majd l,0xl07 sejt/ml koncentrációban Eagle MEM tápoldatban szuszpendáljuk. A tápfolyadék adalékként 0,9 mg/ml gammaglobulin-mentes humán szérumot is tartalmaz. A sejtkultúrát 37 °C-os termosztátban 150 IU/ml humán oC-IFN hozzáadásával két órán ét keverjük, majd 100 HA egység/ml Sendai-virussal indukáljuk az cC-IFN-termelődést és a sejteket további 15-20 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Eztán a sejteket centrifugálással választjuk el az cC-IFN tartalmú tápfolyadéktól, amely a nyers oC-IFN. A PBS-sel egyensúlyba hozott CPG 10/75 töltetet tartalmazó oszlopra nyomjuk a nyers 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
