201100. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy tisztaságú, csökkentett endotoxintartalmú, javított terápiás értékű humán leukocita alfa-interferon előállítására üzemi méretekben
5 HU 201100 B 6 oC-IFN-oldatot 100 ml/tnl CPG mennyiségben. (Az oszloptóltet megjelenési formája üvegpor, amely vízben duzzad és gélesedik, ezért mennyisége ml-ben is megadható.) Foszfátpuffért tartalmazó sóoldattal (PBS) az oszlo- 5 pon meg nem kötött fehérjéket kimossuk. Majd az oC-IFN-t 0,6 mól Tris.HCl puffert és 1,5 mól NaCl-ot tartalmazó, 8,6 pH-jú oldattal eluáljuk az oszlopról. Az eluátumot -20 °C-ra lehűtjük, -20 °C-os etanollal óvatosan elegyitjük úgy, hogy a végső alkoholkoncentráció 75 tf% legyen. Az etanolos elegyet 24 órán át -20 °C-on tároljuk, majd lecentrifugáljuk. A csapadékot eldobjuk, a felülúszót pedig -20 °C-on ultraszűrővel betöményitjük. Az etanolt diafiltrálással távolítjuk el, miközben a közeget vizes pufferoldatra (PBS) cseréljük le. Az Így kapott anyagot ampullákba osztjuk szét és liofilizáljuk. ^ 2. példa A nyers oC-IFN előállítása, majd az ezt követő CPG-kromatográfia megegyezik az 1. példában leírtakkal, azzal a különbséggel, hogy „agammá "-ból 1,5 mg/ml-t használunk. A 75%-os etanolos cC-IFN-oldatból az interferont kicsapással választjuk oly módon, hogy az előbbi alkoholos IFN-oldatot 30 tf% etanolt tartalmazó, 0,05 mólos, pH=5,0 citrátpufferral szemben dializáljuk -20 °C-on. A kicsapódott interferon-fehérjét centrifugálással kiülepítjük és megfelelő mennyiségű PBS-ben felvesszük. Az így kapott terméket is közvetlenül liofilizáljuk. 25 30 35 3. példa A 2. példában leírt módon járunk el, azonban a 75%-os etanolos oC-IFN-oldatot ultraszűrővel 8-10 mg/ml fehérjekoncentráció ^ eléréséig betöményitjük, majd 20% etanolt * tartalmazó, 0,05 mólos, pH=5,0 citrátpufferral szemben dializáljuk. A továbbiakban a kicsapódott fehérjét a 2. példában leírt módon kezeljük. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán leukocita oC-interferon előállítására a vér fehérvérsejtdús frakciójának elválasztása, a vörösvértestek ammóniumklorid-oldattal történő eltávolítása, a leukocitáknak foszfátsókkal pufferolt, az élettanilag szükséges aminosavakat, ásványi sókat és vitaminokat tartalmazó tápoldatban való szuszpendálása, a szuszpenzió humán leukocita oC-interferonnal történő előkezelése, az interferontermelés Sendai-vírus hozzáadásával történő indukálása, az oC-interferontartalmú folyadéknak a sejtektől való elválasztása és a nyers humán oC-interferon tisztítása útján, azzal jellemezve, hogy a vörösvértestek eltávolítására 6,0-7,5 pH-értékre pufferolt ammóniumklorid-oldatot használunk, a tápoldatot gammaglobulin-mentes humán vérszérum 0,5-2,5 mg/ml-nyi mennyiségével egészítjük ki, a fehérvérsejteket az indukcióhoz 0,5 . 107 - 1,5 . 107 sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk a tápoldatban és a termék tisztítását adszorpciós kromatográfia és etanolos frakcionálás kombinációjával végezzük, oly módon, hogy az adszorpciós kromatográfiát szabályozott, átlagosan 70-80 A pórusméretű, 80-400 mesh szemcseméretű üveg állófázison hajtjuk végre. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adszorpciós kromatográfiás tisztításhoz állófázisként előduzzasztott üveg oszloptöltetet alkalmazunk. 3. Az 1-2. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oszloptöltet 1 ml-ére számítva 50-200 ml nyers oC-ínterferont viszünk fel. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oszlopról eluálódó folyadékot vizes etanollal oly módon elegyítjük, hogy az eluáturaban az etanol végkoncentrációja 55 tf%-75 tf% legyen. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az etanolos kezelést 0° és -40 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest - A kiadásért felel: dr Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4960 - KJK 90.3346.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató 5
