201100. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy tisztaságú, csökkentett endotoxintartalmú, javított terápiás értékű humán leukocita alfa-interferon előállítására üzemi méretekben
1 HU 201100 B 2 A találmány tárgya új eljárás humán leukocita oC-interferon előállítására a vér fehérvérsejtdús frakciójának elválasztása, a vörősvértestek ammóniumklorid-oldattal történő eltávolítása, a leukocitáknak foszfátsókkal pufferolt, az élettanilag szükséges aminosavakat, ásványi sókat és vitaminokat tartalmazó tápoldatban való szuszpendálása, a szuszpenzió humán leukocita oC-interferonnal történő előkezelése, az interferontermelés Sendai-virus hozzáadásával történő indukálása, az cí-interferontartalmú folyadéknak a sejtektől való elválasztása és a nyers humán oC-interferon tisztítása útján, oly módon, hogy a tisztítást szabályozott pórusméretű üvegen való adszorbeáltatásnak (controlled pore glass vagy CPG-kromatográfia) és alkoholos frakcionálésnak a kombinációjával végezzük. A CPG-kromatográfia voltaképpen gélpermeációs kromatográfia, amely a vizes közegben duzzasztott üveggél pórusaiban végbemenő szelektív adszorpción alapuló szeparációs technika. Alkalmazása a találmány szerinti eljárásban előnyösen valósítható meg a .CPG' jelű (Sigma katalógusszám: 44710-12) üveg oszloptöltettel, melyet használat előtt az alkalmazott pufferben elöduzzasztunk. A humán leukocita oC-interferon (oC-IFN) antivirális aktivitással rendelkező fehérjecsalád. Az antivirális hatáson kívül számos biológiai hatással is rendelkezik: sejtproliferációt gátló hatású, aktiválja a természetes ölő sejteket, és egyéb módokon is befolyásolja az immunrendszer működését. Ezen tulajdonságok alapján az oC-IFN hatékonyan felhasználható terápiás készitményként is. A terápiásán felhasználható cC-interferon gyártására alkalmas eljárásnak több különleges követelményt is ki kell elégítenie. Így csak szigorúan limitált mennyiségben tartalmazhat bakteriális endotoxint, úgy hogy az eljárásnak még vírussal szennyezett alapanyagok felhasználása esetén is önmagában biztosítania kell a vírusmentességet és a biológiailag aktív altípusok minél szélesebb spektrumával kell rendelkeznie, továbbá a gazdaságosság érdekében a kihozatalnak is megfelelőnek kell lennie. Megfelelő tisztaságú cC-IFN előállítására számos módszert alkalmaztak. így például Sephadex G-100 vagy G-150 [Bodo, G.: Methods. Enzymol 78, 69 (1981)] illetve Ultragel AcA 54 [Whitman, J.E. et al: J. Interferon Res. 1, 305 (1981)] kromatográfiát, szulfo-propil-Sephadex-en végzett kromatográfiát [Bridgen, P.. et al., J. Bioi. Chem. 252, 6585 (1977)], Phenyl Sepharose-pn végzett kromatogréfiát [Whitman, J.E. et al., J. Interferon Res. 1, 305 (1981), Cu-kelát kromatográfiát [Berg.K., Scand.J. Immunoi. 11, 489 (1980)], CPG-kromatográfiát [Chanda,K.C. J.Interferon Rés. 2, 229, (1982)]. Noha a fenti módszerek kombinációival homogén cí-IFN preparátum nyerhető, a kitermelés meglehetősen alacsony, és nem mindegyik eljárás alkalmas a technológiai méretek növelésére. Nagy mennyiségű, terápiás minőségű cC-IFN előállítására a következő módszereket dolgozták ki eddig. Cantell és munkatársai olyan tisztítási eljárást dolgoztak ki, amely egy sorozat pH-kontrollált precipitációs lépésből áll, s amelynek eredményeként 2xl06 IU/mg fehérje specifikus aktivitású oC-IFN nyerhető 50%-os kitermeléssel. A nyers leukocita oC-IFN-t píl=3,5 mellett KSCN-dal kicsapják, majd savas etanolban oldják, a szennyező anyagokat a pH lépcsőzetes emelésével (5,3, majd 5,8) szelektíven kicsapják. Az etanolos oldatból az cC-IFN-t, a pH 8,0-ra történő emelésével viszik csapadékba, majd 0,1 mól foszfátpufferben visszaoldják. A puffer 0,5 mól KSCN-ot is tartalmaz. A szennyezéseket a pH 5,2-re történő csökkentésével precipitélják. A még oldatban lévő cí-lFN-t pH=3,0-nál csapják ki. Ezt követően 0,1 mól pH=8,0 foszfétpufferben a csapadékot feloldják és foszfátokkal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS) szemben dializálják [Cantell et al., Methods of Enzymol. 78, 499 (1981)]. A Wellcome Research Laboratories tisztítási eljárást dolgozott ki Namalva sejtekből származó oC-IFN-ra. Az így nyerhető átlagos specifikus aktivitás 6.107 IU/mg fehérje. [Reuveny, S. et al., Ann.Virol. 133, 191 (1982)]. A nyers limfoblasztoid cC-IFN-t 2,5% triklórecetsavval kicsapják, majd a csapadékot 94%-os etanollal extrahálják pH=3,5-nél. Az etanolos extraktumot a pH lépésenkénti emelésével tisztítják. Az így nyert oC-interferont poliklonális ellenanyag-affinitás kromatográfiával tisztítják tovább. Egy kétlépéses kromatográfiás eljárást dolgoztak ki magas tisztaságú oC-IFN előállítására a New York Blood Center munkatársai [Horowitz,B. Methods of Enzymol. 119, 39 (1986)). A nyers oC-IFN-t CPG-10/75 tölteten adszorbeáltatják, majd 50% etilénglikolt tartalmazó pufferrel eluálják. A eluátumot monoklonális ellenanyag-affinitás kromatográfiával (NK2-Sepharose, Celltech) tisztítják tovább. A kapott anyag specifikus aktivitása 3,6x10s IU/mg fehérje, a kitermelés 50%-os. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával olyan termék nyerhető, amely az interferon-preparátummal, illetve az előállítási eljárással szemben támasztott alábbi követelményeknek megfelel:- a termék endotoxintartalma a nemzetközileg elfogadott határértéknél kisebb, nem több mint 5 IU/106 1U oC-IFN;- az eljárás önmagában biztosítja a végtermék nagyfokú tisztaságét és vírusmentességét még akkor is, ha a kiindulási anyagok virussal szennyezettek voltak - a ké-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
