201097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin-származékok és az azokat tartalmazó nyújtott hatású gyógyszerkészítmények előállítására
Jő Ilii 201097 11 16 származékot úgy kristályosítjuk, hogy hozzáadunk 1100 ml vizet, annyi szilárd trinátrium-citrátot, hogy arra nézve 0,05 mólos legyen és annyi szilárd cink-acetátot, hogy erre nézve 0,006 mólos legyen. Végül a pll-t 6,8 értékre állítjuk be. Miután egy éjjelen át keverjük 4 °C-on, a kristályokat centrifugálással izoláljuk, vízzel egyszer mossuk és vákuumban szárítjuk. A hozam: 1,00 g, amely 65%-nak felel meg az utolsó lépésben és 19% a Gin*17, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-2) inzulin prt: kurzorból számítva. A termék közel homogén DISC PAGE elektroforézissel 8,9-es pll-nál, a migráció sebessége 35%-a az inzulinénak. Analitikai HPLC-ben a termék a sertés inzulin előtt jön le, a tisztaság kb. 97%. Aminosav összetétel analízis 2 lizincsoporLot mutat molekulánként és különben azonosságot a humán inzulinnal. ti. példa Arg*21, Tln^-NHz human inzulin szintézise 3,8 g Arg®27, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) inzulin prekurzort 18 mi ecetsav /viz/ DMF (11,4 ml ecetsav, 35 ml viz, DMJ’-el 100 ml-re kiegészítve) elegyében szuszpendálurik, hozzáadunk 36 ml, DMF-ben oldott 1 mólos Thr-NÜ2 oldatot. Az elegyet 12 “C-ra hütjuk és 0,38 g sertés tripszint adunk hozzá, melyet 6,84 ml 0,05 mólos kalcium-acelátban oldottunk. 48 órán át állni hagyjuk 12 °C-on majd a proteineket acetonnal kicsapjuk, amint a 4. példában leírtuk. A származékot HPLC-vel tisztítjuk, amint az 1. példában leírtuk, először 1800 ml eluensL használunk, amely 35 rész etanaiból és 65 rész vizes 0,3 mólos, kálium-kloridból, mely sósavra nézve 0,001 n áll, ezután olyan eluenssel, mely 37 rész etanolból és 63 rész vizes oldatból áll. A származék 10 perccel az eluens váltása után jön le és úgy izoláljuk, mint azt a 4. példában leírtuk a Gin*17, Thrwu-NH2 inzulinnál. Végül SP-SephedexTM C-25 oszlopon tisztítjuk, amint az az 5. példában le van írva a Gin*17, LysB30-NH2 humán inzulin esetében. Az Arg627, ThrBJU-Nll2 humán inzulin hozam 1,63 g, ez 43%-nak felel meg. Lényegében egy sávot lehet látni a DISC PAGE eiektroforezissel, a migráció sebessége 55%-a az inzulinénak. Analitikai HPLC-ben a termék a sertés inzulin előtt jön le, tisztasága kb. 96%. Aminosav összetétel analízis 2 arginincsoportot mutat molekulánként és különben azonosságot a humán inzulinnal. 7. példa Arg*21, Lysl,M-.\IU humán inzulin szintézise A vegy illetet 3,61 g Arg827, IM1-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) inzulin prekurzorból szintetizáljuk, az 5. példában leirt módszerek szerint. Az ArgB27, LysBi0-NH2 humán inzulin hozam 0,78 g = 22%. DISC PAGE elektroforézissel egy nagyobb sáv migrációja 35%-kal tér el az inzulin migrációjától. Két kisebb sáv látható. Analitikai HPLC-ben a tisztaság 92%; a termék a sertés inzulin előtt jön le. Aminosav összetétel analízis 2 arginin- és 2 lizincsoporLot mutat ki molekulánként és különben azonosságot mutat a humán inzulinnal. H. példa L.vs1127, TluM")-MU humán inzulin szintézise A vegyuletet 7,0 g LysB27, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) inzulin prekurzorból szintetizáljuk, a 6. példában leírt módszereket alkalmazva. A LysB27-, ThrB30-NH2 humán inzulin hozam 3,15 g, ez 45%-nak felel meg. DISC PAGE elektroforézis egy nagyobb sávot és két kisebb sávot mutat, a nagyobb sáv migrációja 55%-kai tér el az inzulin vonatkozási sáv'játói. Analitikai HPLC-vel a tisztaság 96%-os. A vegyület előbb jön le mint a sertés inzulin a fordított fázisú HPLC-ben. Aminosav összetétel analízis 2 lizincsoportot mutat molekulánként, különben azonosságot mutat a humán inzulinnal. 0. példa Lysh27 - Lysiau-Ml2 hunién inzulin szintézisé A vegyületet 7,0 g LysB27, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A( 1-21) inzulin prekurzorból szintetizáljuk, az 5. példában leírt módszerek szerint. A LysB27, LysB30-NH2 humán inzulin hozam 1,57 g, ez 22%-nak felel meg. DISC PAGE eletroforézis egy nagyobb sávot mutat, melynek migrációja 35%-kal tér el a sertés inzulinétól. Kis szennyeződés látható. Analitikai HPLC-vel a tisztaság 94%-os, a vegyület jói eluálódik, előbb mint a sertés inzulin. Aminosav összetétel analízis 3 lizincsoportot mutat ki molekulánként különben azonosságot mutat a humán inzulinnal. 10. példa GinB13, Thi*M-NIh humán inzulin szintézise A vegyiileteL 3,05 g Gin813, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) inzulin prekurzorból szintetizáljuk, a 6. példában leirt módszereket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
