201097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin-származékok és az azokat tartalmazó nyújtott hatású gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 201097 B 14 készített oldatát. 72 órai állás után 12 °C-on a proteinek kicsapódnak 200 ml aceton- hozzáadására és a csapadékot centrifugálissal izoláljuk. A csapadékot egyszer mossuk 100 ml acetonnal, centrifugálissal izoláljuk és vákuumban szárítjuk. A ThrB30-Nll2 humán inzulint a tripszintöl és a nem reagált, sertés inzulintól megtisztítjuk úgy, amint az a humán inzulin észtereire le van Írva llásd Markussen: Methods in Diabetes Resarch, Vol. 1. Editors: Larner and Pohl (1984), 408] Hozam: 599 mg. A termék homogénnek mutatkozik DISC PAGE elektroforézissel 8,9. pH értéknél, a migráció sebessége 75%-a az inzulinénak. Az aminosav összetétel megegyezett az elmélettel, vagyis 3 treonincsoport és 1 alanincsoport volt inzulin molekulánként. A 4-10. példákban lévő kiindulási anyagokban az (II) általános képlet szerinti (Qq-R)r általános képletü csoportjaként AlaAla-Lys-et választottuk és úgy állítottuk elő, amint az le van írva a pMTBIO élesztő plazmidra az 582/85 dán nyilvánosságrahozatali iraL 10. példájában. Gin1113, GlnA17, Arg"37 és Lys“27 jelű nukleotidokat helyettesítettünk a pMT610-ban helyspecifikus mutagénézissel a Nuel.Acids.Res. 11, (1983), 5103-5112 idézetben leirt eljárást alkalmazva. 4. példa Gin*1', Thi^-Klh humán inzulin szintézise 3,12 g Gin'*7, B( 1-29)-Ala-Ala-I.y s-A( 1--21) inzulin prekurzort 15 ml ecetsav /DMF/ víz (11,4 ml ecetsav 85,1 ml DMF, vízzel 100 ml-re kiegészítve) elegyében szuszpendálunk, ehhez hozzáadunk 30 ml 1 mólos, DMF-ben oldott Thr-Nllz-L. Az elegyet lehűtjük 12 °C-ra és 7,5 ml 0,05 mólos kalcium-acetátban feloldott 0,3 g sertés tripszint adunk hozzá. A keverést addig folytatjuk, míg az inzulin prekurzor feloldódik. 48 óra múlva 12 °C-on a proteinek kicsapódnak 400 ml aceton hozzáadása következtében. A proteineket centrifugálással választjuk el, egyszer mossuk 100 ml acetonban és vákuumban szárítjuk. A csapadékot feloldjuk 70 ml 0,04 n sósavban, a pH-t 2,5 értékre beállítjuk és a származékot HPLC-vel tisztitjuk, amin azt az 1. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy olyan eluenst használunk, mely 35 rész etanolból és 65 rész 0,3 mólos kólium-kloridból, 0,001 n sósavból áll. A származék az oszlopról kb. 3 oszloptérfogat után jön le, és úgy izoláljuk, hogy egymásután adunk hozzá 1 térfogat vizet, szilárd Lrinátrium-citrátot, hogy erre nézve 0,05 mólos legyen és szilárd cink-acetátot, hogy erre nézve 0,006 mólos legyen. Ezután beállítjuk a pH-t 6,5 értékre, egy éjjelen át keverjük 4 °C-on, majd a kristályokat centrifugálással összegyűjtjük, vízzel mossuk és szárítjuk. A hozam 1,64 g = 53%. További tisztítást anion-cseréló kroinatográfiával végzünk, amint az a humán inzulin-észterekre le van írva (lásd Markussen, ibid. 410). Végső hozam: 1,15 g = 37%. A termék közel homogén DISC PLATE elektroforézissel pH = 8,9 értéknél, a migráció sebessége 55%-a az inzulinénak. Analitikai fordított fázisú Hl’LC-ben (lásd Markussen ibid, 410), a termék kb. ugyanolyan sebességgel eluálódik, mint a sertés inzulin. A tisztasága kb. 95%-os. Aminosav összetétel analízis a feltételezett formulával azonosságot mutatott. 5. példa Glnflíl, L,vshW-Nlh humán inzulin szintézise 3,15 g Gin'17, B( 1—29)-Ala-Ala-Lys-A(1 - -21) inzulin prekurzort 15 ml ecetsav /DMF/ víz (4,57 ml ecetsav, 71,9 ml DMF vízzel 100 ml-re kiegészítve) elegyében szuszpendálunk, ehhez hozzáadunk 30 ml, DMF-ben oldott, 0,4 mólos Lys(Boc)-NH2-t. Az elegyet 12 °C-ra hütjük és hozzáadunk 0,3 g tripszint melyet 7,5 ml 0,05 mólos kalcium-acetátban oldottunk. A keverést folytatjuk, míg az inzulin prekurzor feloldódik. 12 °C-on tartva, 48 óra múlva a proteineket izoláljuk, amint azt a 4. példában leírtuk. A csapadékot 70 ml 0,04 n sósavban feloldjuk, a pll-t 2,5 értékre állítjuk be és a Gin*17, Lys(Boc)B30-NH2 humán inzulint HPLC-vel tisztitjuk, amint az 1. példában leírtuk azzal a különbséggel, hogy az eluciót először 2,3 1 olyan eluenssel végezzük, mely 37 rész elánok és 63 rész 0,3 mólos kálium-kloridot tartalmaz 0,001 n sósavban, ezután egy olyan eluenssel, mely 39 rész etanolt és 61 rész 0,3 mólos kálium-kloridot tartalmaz 0,001 n sósavban. A származék 25 perc múlva jön le az eluens változtatása után és úgy izoláljuk, amint azt a Gin*17, ThrB30-NH2 humán inzulin esetén leírtuk a 4. példában. A hozam Gin*17, LysfBocl^-NHz humán inzulinra 906 mg = 29%. Gin*17, Lys(Boc)B30-NH2 humán inzulint (1,55 g) feloldunk 30 ml trifluor-ecetsavban (TFA) és szobahőmérsékleten 2 órán keresztül állni hagyjuk. A TFA-t liofilizálással eltávolítjuk. A maradékot feloldjuk 15 ml vízben, a pH-t 3-as értékre állítjuk be 1 n nátrium-hidroxiddal és 22 ml etanolt adunk hozzá. Az oldatot egy 2,5 x 20 cm SP-SephadexTMC-25 oszlopra visszük, melyet 3 : 2 térfogat arányú etanol-viz elegyből álló pufferral hozunk egyensúlyba, mely 0,01 m citromsavból, 0,03 m nátrium-kloridból áll és a pH-t 4,5 értékre állítjuk he nátrium-hidroxiddal. Az oszlopot ugyanazzal a pufferral eluáljuk, 0,03-0,4 mólos nátrium-klorid lineáris gradienst, összesen 1,6 1 eluenst használva. A származék 440 nd-ben eluálódik, amikor a gradiens 0,2 m nátrium-kloridot ér el. A 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
