201097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin-származékok és az azokat tartalmazó nyújtott hatású gyógyszerkészítmények előállítására
11 11U 201097 li 12 nézve. Ugyanazzal a pufferral eluálunk 2 liter/óra sebességgel és a l,ysB30-NH2 csúcsot 55 és 90 perc között kapjuk meg. A terméket izoláljuk a frakcióból, amint azt fent leírtuk a 1,j,s(Boc)b;*u-NH2 humán inzulin esetében, azzal a különbséggel, hogy a cinket tartalmazó citrát-puffer-ban való kristályosításban a pH értéket 7-re állítjuk be, 6,5 helyett. Hozam: 262 mg tiszta l.ysB3u-Ml2 humán inzulin. Az aminosav összetétel az elmélettel egyezik, a molekula 1 alanint és 2 lizint tartalmaz. A termék tiszta, DISC PAGE elektroforézissel vizsgálva 8,9 pll-nál, a migrációsebesség a sertés inzulinénak 55%-a, amely megfelel kb. 2 töltés különbségnek. A DISC PAGE elektroforézis részleteire lásd: Horni. Metab. Res. Supplement Series No. 5 (1974). 134. 2. példa ArgBM-NiÍ2 humán inzulin és Arg030- -ArgBJl-NH2 humán inzulin szintézise 1 g sertés inzulint feloldunk 3,32 ml 8 mólos ecetsavban és 3,9 g Arg-NHz, (CH3COOH)2-at (L-arginin-amid dihidro-acetát sója) 10 ml-re oldunk N,N-dimeLil-formamidban (a továbbiakban DMF), az oldatokat elegyítjük és az elegyet 12 °C-ra hütjük, 0,1 g tripsziíit 1,2 ml 0,05 mólos kalcium-acetát-oldatban oldunk és a fenLi elegyhez hozzáadjuk. 144 óláig állni hagyjuk 12 °C-on, utána a proteineket 200 ml aceton hozzáadásával lecsapjuk és a csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot egyszer mossuk 100 ml acetonnal, centrifugálással izoláljuk és vákuumban szárítjuk. A csapadékot feloldjuk 50 ml, (27/73 térfogut arányú) etariol/vízzel készült 0,01 n sósavban és a proteineket preparativ kromatográfiás oszlopra visszük, amint azt az 1. példában leírtuk. Először egy olyan eluenst, mely 35 térfogatrész etanolból és 65 rész 0. 3 mólos olyan kálium-klorid-oldatból áll, amely 0,001 n sósavra nézve pumpálunk át 2 liter/óra sebességgel, 4 óra alatt. Három, felbontatlan csúcs mutatkozik, kb. 60-tól 120 percig, 120-tól 150, és 150-tol 180 percig. A három frakció proteinjeit úgy izoláljuk, amint az az 1. példában LysB30-NH2 esetén le van írva. Hozamok: 414 mg, 142 mg és 107 mg az 1, II. és III. frakcióra vonatkoztatva. Aminosav analízis DISC PAGE elektroforézissel kombinálva azt mutatja, hogy az I. frakció inzulin molekulái 2—tői néhány argininnel kapcsolódnak. A II. frakció nagyobb része egy-egy arginin-amid-rsoporthoz kapcsolódó inzulin vagyis ArgBJU-NHz humán inzulin. A III. frakció egy olyan elegy, mely sertés inzulint, des(I)30) humán inzulint, Arg8-*0 humán inzulint és ArgB-,0-NlÍ2 humán inzulint tartalmaz. ArgBM-.\ll2 humán inzulin A II. frakció proteinjeit feloldjuk 10 ml, 3/2 térfogatarányú etanol/víz elegyében, 2 pll-értéknél. Miután 12 mg EDTA-t hozzáadunk, a pH-l 10-es értékre növeljük 0,1 n nátrium-hidroxiddal. Az oldatot egy 2,5 x x 25 cm QAE-Sephadex A-25 oszlopra viszszük, ezt egy olyan pufferral hozzuk egyensúlyba, amely 0,5 ni ammóniából, 0,05 n sósavból és 0,04 mólos nétrium-kloridból készült 60% (v/v) etanolban. Az oszlopot 30 ml/óra sebességgel eluáljuk, lineáris graádienssel 0,04 m-0,1 m nátrium-kloridban: összesen 1 liter eluenst használva fel, miközben a pll-t konstansan kb. 10,0 értéken tartjuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk. ArgB3U-NH2 humán inzulin az oszlopról az 58-74 frakciókban jön le. A terméket az összegyűjtött frakciókból bepárlással izoláljuk, majd kristályosítjuk pH = 7 értéknél egy cinket tartalmazó citrát pufferben, mely 15% (v/v) acetont tartalmaz, amint azt az 1. példában LysB3ü-NIl2 esetére leírtuk. Hozam: 53 mg. A termék homogénnek mutatkozik DISC PAGE elektroforézissel pH = 8,9-nél, a migráció sebessége az inzulinének 55%-a. Az aminosav-összetétel megegyezik az ArgB:iű-NH2 humán inzulinra vonatkozó elmélettel, amely szerint 2 argininL és 1 alanint tartalmaz inzulin molekulánként. ArgB30-ArgB31-NU2 humán inzulin Az I. frakció proteinjeit feloldjuk és ioncserélő kromatográfiénak vetjük alá, QAE-SephadexTM A-25-oszlopon, amint azt a II. frakció proteinjeire leírtuk. Arg^-Arg831- —NHz humán inzulin az oszlopról a 34-47 számú frakciókban jön le. A terméket izoláljuk amint azt az I. példában a bys^^NHz humán inzulinra leírtuk. Hozam: 10 mg. A termék homogénnek mutatkozik DISC PAGE elektroforézissel 8,92 pH értéknél, a migráció értéke az inzulinénak 35%-a. Az aminosav összetétel 3 arginincsoportot és 1 alanincsoportot. mutat egy inzulin molekulára számítva. 3. példa ThrB3ü-Nfl2 humán inzulin szintézisre (referencia példa) 1 g sertés inzulin feloldunk 5 ml 10 mólos ecetsavban és 2,365 g Thr-NH2-t (L-treonin-amid, szabad bázis) N,N-dimetil-acetamidban szuszpendálunk úgy, hogy a szuszpenzió térfogata 13 ml legyen. Az inzulinoldatot és a szuszpenziót elegyítjük. Öszszekeverés után a Thr-NH2 feloldódik. Az elegyet 12 °C-ra hütjük és hozzáadjuk 0,1 g tripszinnek 2 ml 0,05 mólos kalcium-acetáttal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
