201097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin-származékok és az azokat tartalmazó nyújtott hatású gyógyszerkészítmények előállítására
a HU 201097 13 10 acetót- és citrátpuffert, és tartósítószereket, amilyen a m-krezol vagy fenol. Az oldat pH értékét a semlegesség felé állítjuk be, anélkül, hogy túlságosan megközelítenénk az (I) általános képletű vegyületek izoelektromos pontját, nehogy csapadék váljon ki. A végleges inzulin készítmény pH értéke függ a töltések számából, amelyet megváltoztattunk az (I) általános képletű vegyületben, a cinkionok koncentrációjától, az (I) általános képletű vegyület koncentrációjától és a kiválasztott (I) általános képletű vegyülettól. Az inzulin készítményt steril szűréssel sterilizáljuk. A találmány szerinti inzulin készítményeket hasonlóképpen használjuk, mint az ismert inzulin készítményeket. Az aminosavakra itt használt rövidítések azok, melyek a J.Biol. Them. 243, 3558 (1968) közleményben vannak ismertetve. Az itt ismertetett aminosavak I,-konfigurációban vannak. Az (1) általános képletben és bárhol az A(l-3) jelentése Gly-Jle-Val, A(5—6)é C.ln-Cys stb., lásd: a humán inzulin aminosav sorrendje. Eltérő utalás hiányában az itt említett inzulinok fajtái humán inzulinok. Az inzulin forrása vagy sertés inzulin vagy egy élesztőben előállított inzulin prekurzor amint azt az 582/85 számú dán nyilvánosságrahozatali iratban leírjuk. Az inzulin prekurzorokat a fermentációs táptalajból nyerjük ki Li Chro prepTM KP-18-ra való abszorpcióval, amint a fenti dán szabadalmi leírás 7. példájában le van írva. A prekurzorokat az oszlopról 0,2 mólos kálium-kloriddal, 33%-os (v/v) etanolban oldott 0,001 mólos sósavval eluáljuk. Az inzulin prekurzorokat kristályosítjuk az összegyűjtött frakcióba, egymásután adagolva vizet (1 v/v frakció), szilárd trinátrium-citrátot (hogy 0,05 mólos legyen) és végül cink-acetatot (hogy 0,006 mólos legyen). A pH-t 6,8 értékre állítjuk be és az elegyet egy éjjelen át állni hagyjuk 4 °C-on. A kristályokat centrifugálással izoláljuk, vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk. Védett aminosavakat és védett peptideket az enzimes szemiszintézis céljából vagy standard módszerekkel állítanak elő, vagy megvásároljuk (rendelésre készült szintézis) akár a Nova Biochem-től, akár a Bachem-töl, mindkettő svájci cég. A TM betűk a nevek után védjegyet (trade mark) jelentenek. 1 1. példa A LysB3a-NH2 humán inzulin szintézise 1 g sertés inzulint feloldunk 4 ml 7,5 mólos ecetsavban és 6,1 g Lys(l3oc)-NH2, ClbCOOH-t (N epszilon-Boc-L-lizin-amid-acetát-só) feloldunk 15 ml-re N,N-dimefi)-acetamiddal, az oldatokat elegyítjük és az elegyet 12 °C-ra hűtjük, 0,1 g tripszint. feloldunk 2,08 ml 0,05 mólos kalcium-acetátban és az oldatot az elegyhez adjuk. 96 órai állás után 12 °C-on a proteineket kicsapjuk 200 ml aceton hozzáadásával és a csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A csapadékot egyszer mossuk 100 ml acetonnal, centrifugálással elválasztjuk és vákuumban szárítjuk. A csapadékot feloldjuk 50 ml 0,01 n sósavban, mely etanol/vizzel (28/72 térfogat arányban) készült, és az oldatot egy 5 x x 30 cm-es preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra visszük (a továbbiakban HPLC), melynek töltete oktadecil-dimetil-szilillel helyettesített kovasav (átlagos részecskeméret 15 mikron, pórusméret 100 Angström). Az oszlopot egyensúlyba hozzuk 38/62 térfogat arányú etanol/0,2 mólos ammóriium-szulfát-oldatta), ez utóbbi pH-ját 3,5-re állítjuk be kénsavval. A proteineket az oszlopról ugyanazzal a pufferrel eluáljuk, 2 li- Ler/óra sebességgel. A Lys(Boc)B:ja-NH2 humán inzulint, egy olyan csúcsban találjuk meg, melyet az oszlopról 60 és 75 perc között eluálunk, a nem reagált sertés inzulin eluciója után. Az etanolt vákuumban elpároljuk és a bepárlást folytatjuk, mig a térfogat kb. 125 ml-re csökken. A Lys(Boc)B30-NH2 humán inzulint izoláljuk 25 ml aceton, 100 mg eitromsav (monohidrát p.a.) és 9 mg cink-klorid (p.a.) egymásutáni adagolásával. A pll-t 6,5 értékre állítjuk be és egy óráig szobahőmérsékleten, majd 24 órán át 4 °C-on, enyhe keverés mellett kristályosítunk. A kristályokat lecentrifugáljuk, egyszer mossuk 5 ml jéghideg vízzel, centrifugáljuk és vákuumban szárítjuk. Hozam: 456 mg Lys(Boc)B3°-NH2 humán inzulin. A l.ys(Boc)B30-NH2 humán inzulint (456 mg) feloldjuk 15 ml trifluor-ecetsavban és 3 órán át állni hagyjuk szobahőmérsékleten. A trifluor-ecetsavat liofilizálással eltávolítjuk. A iiofilizátumot feloldjuk 50 ml vízben, a pH-t 2,5 értékre állítjuk be és 10 g nátrium-kloridot adunk hozzá. A LysB30-NH2 humán inzulin só-lepényt centrifugálással elkülönítjük. A só-lepényt 125 ml vízben feloldjuk és a LysB:iu-NH2 humán inzulint kristályosítjuk, 25 ml aceton, 100 mg citromsav (monohidrát p.a.) és 9 mg cink-klorid (p.a.) egymásutáni adagolásával és a pH-t 7,0 értékre állítjuk be. Egy óráig szobahőmérsékleten tartjuk, majd a kristályosítást 4 °C-on folytatjuk 24 órán keresztül, enyhe keverés mellett. A kristályokat lecentrifugáljuk, egyszer mossuk 5 ml jéghideg vízzel, ismét centrifugáljuk és szárítjuk. Hozam: 387 mg nyers LysB30-NH2 humán inzulin. A kristályokat feloldjuk 50 ml 0,005 n sósav bún, amely etanol/víz (20/80 térfogaturány (-elegy ben van oldva és az oldatot preparatív lll'LC oszlopra visszük, mint azt fent leírtuk, ekkor egyensúlyba visszük egy olyan oldattal, mely 35,5 térfogatrész etanolból és 64,5 térfogatrész 0,3 mólos olyan káli— um-klorid-oldatból áll, amely 0,001 n sósavra 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
