201097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin-származékok és az azokat tartalmazó nyújtott hatású gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 201097 B 8 (111) ahol Y, 2, R, in és n jelentése a fentiekben definiált, és ahol az Y és 2 oldallánci aminocsoportjai és hidroxicsoportjai adott esetben blokkolva vannak amino- és hidroxi-védöcsoporlokkal, Lripszint vagy egy tripszinhez hasonló enzimet használva katalizátorként víz és szerves oldószerek elogyében, amint az le van írva, a 4 3-13 898 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Előnyös (III) általános képletü vegyületek, melyeket ebben az eljárásban használunk: Thr-NH2, Lys (Boc)-NHz, Thr(nu')-OBu,) Thr-OBu*, Ala-NH2 és Arg (BocJ-Nlh. Az aminocsopot— tokból származékokat állíthatunk elő egy zsírsavval való acilezésse). A hidroxicsoportokat. alkilezéssel védhetjük. Ha Y és Z olyan csoportokat tartalmaznak, melyeket reverzibilisen blokkolnak amino-védöesoportok, ezeket a csoportokat el lehet távolítani egy későbbi lépésben, szükség szerint, miután az amino-védett kóztiterméket elválasztottuk a tripszintól, vagy a tripszinhez hasonló enzimtől. Tripszinhez hasonló enzimek közül az Achvomabacter lyticus-ból kinyert lizil endopept.idáz alkalmas. A (II) általános képletü vegyületet kialakíthatjuk egy gazdaszervezetben, úgymint élesztőben, a 163 529 számú európai szaha-A( 1-3 l-E'-AI 5-0 )-Cys-A(8-16 )-E2-S S B( 1- 6) - C y s- D (8—12)—E3-Lys-Pro-.Y-B( dalmi bejelentésben leírtakhoz hasonlóan úgy hogy egy olyan gént alkalmazunk, amelynek a megfelelő kodonjai vannak a kérdéses aminosavakra nézve. A gént, mely az új inzulin- 5 származékot kódolja, ekkor egy olyan alkalmas expressziós vektorba illesztjük, amelyet ha az élesztőbe átviszünk, képes arra, hogy kialakítsa a kívánt vegyületet. Az előállított terméket ezután izoláljuk a sejtekből vagy a 10 táptalajból, altól függően, hogy ki van-e választva a sejtekből, vagy nem. Egy reverzibilis amino-védöcsoportra példa a terc-butoxi-karbonil-csoport és egy reverzibilis hidroxi-védócsoportra a terc-bu- 15 tilcsoport. Az ilyen csoportokat olyan körülmények között távolitjuk el, amelyek nem okoznak nem kívánatos változást az (I) általános képletü vegyületekben, például trifluor-eeetsavval. 20 (I) általános képletü inzulinvegyületeket előállíthatunk egy kapcsolásos reakcióval is, melyben egy olyan (IV) általános képletü vegyületet - amelyben E1, E2, E3, E4 és X a fentiekben definiált - kapcsoljuk egy, a fenti 25 (111) általános képletü aminvegyülethez, tripszinnel, vagy a tripszinhez hasonló enzimmel olyan körülmények között, melyek a 17 938 számú európai szabadalmi leírásban le vannak írva. A(18-19)-Cys-Asn (A-lánc) S s (IV) B(14-18)-Cys (B-lánc) 26—22 )-E4-Gly Ha az inzulint genetikai átalakítással állítjuk elő, a további egy vagy két pozitív töltést alkalmasan bevihetjük az irizuiinmolekulán belül, vagyis az A17-, B13-, vagy B27- -helyzetben, lehetőséget adva a tripszin-ka- 50 talizálta szemiszintézisnek, hogy a B-lánc C-terminális karboxilcsoportját. blokkolja egy aminosav-amid vagy egy aminosav-észter. Annak az előnye, hogy beviszünk további pozitív töltéseket az irizulinmoiekula 51 55 aminosavból álló vázába, és így (I) általános képletü új vegyüieteket állítunk elő, inkább mint hogy meghosszabbítjuk a B-láncot az emlős inzulinok 30 csoportján túl, az előállítás megkönnyítésében mutatkozik meg. A 60 szemiszintetikus transzpeptidácíóbari az aminosav-amidot, vagy amidosav-észtert nagy moláris feleslegben alkalmazzuk. Ha egy dipeptid-amidot vagy észtert kell alkalmazni a transzpeptidációs reakcióban, vagy a költség, 65 6 vagy az oldhatóság, vagy mindkettő korlátozza a nagy feleslegben való alkalmazást és következésképpen a termék hozama kisebb lesz. Még ha ugyanazt az ekvimoláris feleslegét használjuk pl. a Lys(Boc)-NH2-nek és hys(Boc)-Lys(Boc)-NHz-nek a transzpeptidációs reakcióban hasonló körülmények között, az aminosav-amiddal kapott hozam lényegesen nagyobb lesz, mint a dipeptid-amiddal kapott hozam. A találmány szerinti inzulin készítményeket úgy állítjuk elő, hogy egy (1) általános képletü vegyületet feloldunk vizes közegben, gyengén savas körülmények között, pl. 240 vagy 600 nmól/1 koncentrációban. A vizes közeget izotóniássá tesszük, pl. nátrium-kloriddal, vagy glicerinnel. Továbbá a vizes közeg tartalmazhat cinkionokat, inzulin-aktivitás egységenként legfeljebb kb. 20 wg Zn**-koncentrációig, puffereket, úgymint
