201095. lajstromszámú szabadalom • Az immunrendszer működését gátló új peptidek, az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint eljárás ezen peptidek és készítmények előállítására
10 HU 201095 B (a .törzsoldat' 20:6:11 arányú piridin-ecet- 8av-viz elegy) 1. 19:1 arányú etil-acetát - törzsoldat elegy 2. 9:1 arányú etil-acetát - törzsoldat elegy 3. 6:1 arányú etil-acetát - törzsoldat elegy 4. 7:3 arányú etil-acetát - törzsoldat elegy 5. 3:7 arányú n-butanol - törzBoldat elegy 6. 1:4 arányú n-butanol - törzsoldat elegy 7. 1:1:1:1 arányú n-butanol - ecetsav - etil-acetát - viz elegy. A kromatogramok előhívását ninhidrinnek, valamint klórozást kővetően kálium-jodid/toluidin reagenssel végeztük. A nagynyomású folyadékkromatográfiás méréseket Labor-MIM 308 típusú változtatható hullámhosszú UV-detektorral, Labor-MIM Loop-injektorral, Gilson 802C és 302 egységekből álló adagolószivattyúval és nyomásmérővel, valamint Radelkis OH 827 típusú iró- Bzerkezettel ellátott berendezésben végeztük. Az elválasztáshoz 6 /um szemcseméretű, Cis-fázisú, 150 cm hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű töltetet (Labor-MIM) használtunk. Az eluens lOX-os vizes ammónia-oldattal pH=8-ra beállított 0,2%-os vizes foszforsav-oldat volt. Ezzel a pufferrel vizsgáltuk a tripeptideket, míg a tetrapeptidek vizsgálatához a fenti eluenshez 10 térfogatszázalék acetonitrilt is adtunk. A mérést 1 ml/perc áramlási sebességgel végeztük, 212. nm-en detektálva az oldat fényelnyelését. A kromatogramok kiértékelését terület normalizációval végeztük. A célvegyületek tisztasága mind a nagynyomású folyadékkromatográfiás, mind a vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel mérve meghaladta a 95%-ot. A fajlagos forgatóképességet Perkin-Elmer 241 tipusú polariméterrel határoztuk meg. Valamennyi oldószer-eltávolítást, illetve bepárlást Büchi-féle rotációs vákuumbepárlón végeztünk 40 °C-os vízfürdőn. A köztitermékek és a célvegyületek 1H- és 13C-NMR spektrumait Varian XL A 400 tipusú készülékben vettük fel. A célvegyületeket minden esetben nehézvízben (DzO-ban) oldottuk. A spektrumok összhangban voltak a szerkezettel. A célvegyületek aminosav-analizisét Biotronik LC 5001 tipusú készülékben végeztük. A mintákat 6 mól/1 koncentrációjú sósav-oldatban 110 °C-on hidrolizáltunk 24 órán keresztül. Az analízis eredményei minden esetben ±5%-os hibahatáron belül voltak. A szintézisek kiindulási anyagai az irodalomból jól ismertek. A D-antipódokat D-aminosavakból kiindulva ugyanúgy állítottuk elő, mint az L-antipódokat. 1. példa Arg-Lys-D-Asp előállítása (.A’ módszer) 6,60 g (13,8 mmól) Z-Lys(Boc)-OSu-t és 4,86 g (14,5 mmól) H-D-Asp-ÍOHiu-oxalátot 9 60 ml etil-acetátban reagáltatunk 4,06 ml (29,0 mmól) trietil-amin hozzáadása után. Másnap a reakcióelegyet 20 ml vízzel, háromszor 20 ml 1 mól/1 koncentrációjú BÓsav-ol- 5 dattal, háromszor 20 ml 5%-os vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A bepárlási maradékként kapott, olaj- 10 szerű védett dipeptidet (tömege 6,5 g, Rt2=- 0,8) 70 ml metanolban oldjuk. Az oldathoz 1,5 g csontszenes palládiumkatalizátort adunk, és a szuszpenzión keverés közben 2 órán át hidrogéngázt buborékoltatunk. Ez- 15 után a reakcióelegyet szűrjük és a szúrlethez 1,45 g (11,5 mmól) oxálsav-dihidrátot adunk. Az oldatot bepároljuk, a maradékot éterrel eldörzBöljük és a szuszpenziót szűrjük. így 4,80 g Lys(Boc)-D-Asp(OtBu)-OtBu- 20 -oxalátot kapunk. Op.: 118-121 °C; [oC]20^+11,0° (c=l,0, metanolban); Rf2=0,25. 1,98 g (6,0 mmól) Boc-Arg(- HC1)-0H • • H2O és 0,67 ml (6,0 mmól) N-metil-morfolin 20 ml dimetil-formamiddal készített oldatát 25 -10 °C-ra hűtjük, majd ezen a hőmérsékleten hozzácsepegtetünk 0,78 ml (6,0 mmól) klór-szénsav-izobutil-észtert. A kapott vegyes anhidridet 10 percen át -10 °C-on keverjük, majd hozzáadjuk az előzőekben kapott Lys- 30 (Boc)-D-Asp(OtBu)-OtBu-oxalát 3,27 g-jának (5,8 mmól) és 1,28 ml (11,6 mmól) N-metil-morfolinnak 15 ml dimetil-formamiddal készített és -10 °C-ra hűtött oldatát. Ezután a reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre 35 felmelegedni. Másnap az oldószert vákuumban lepároljuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk, az oldatot háromszor 20 ml 1 mól/1 koncentrációjú sósav-oldattal és egyszer 20 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátri- 40 um-szulfáttal szárítjuk. A szuszpenziót szűrjük, a szürletet vákuumban bepároljuk. Az olajszerű bepárlási maradékot diizopropiléterrel megszilárdítjuk. A kapott szuszpenziót szűrjük, a szüredéket szárítjuk. így 45 3,20 g (4,18 mmól) amorf Boc-Arg(’ HCl)-Lys(Boc)-D-Asp(OtBu)-OtBu tripeptid-észter-sót kapunk. Rf3 *=0,10; Rf*=0,45j [oC]20»*—6,4° (c=l, metanolban). A fenti eljárással előállított további vé- 50 dett peptideket az 5. táblázatban adjuk meg. A fentiek szerint kapott védett tripeptid-észter-só 1,60 g-ját (2,08 mmól) 2 órán át 20 ml trifluor-ecetsavval kezeljük. Ezután a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk és a 55 maradékot éter hozzáadásával megszilárdítjuk. A szuszpenziót szűrjük, és a csapadékot éterrel alaposan mossuk. A kapott trifluor-acetát-sót 20 ml vízben oldjuk, és az oldathoz 5 ml acetát ciklusú Dowex 2x8 jelű 60 ioncserélő gyantát (a Dow Chemical cég gyártmánya) adunk. 30 perc eltelte után a szuszpenziót szűrjük, a szürletet vákuumban bepároljuk, a bepárlási maradékot etanollal megszilárdítjuk. így 1,0 g amorf Arg-Lys-D- 65 -Asp ■ CH3-COOH tripeptid-acetátot kapunk. 7
