201093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére
15 HU 201093 B 16 A fentebb leirt módon szolubilizált és helyreállított szomatotropinokat ezután tisztítottuk standard kromatográfiás technikákkal. A bioaktivitást a patkány növekedési biológiai vizsgálatokra adott pozitív válasz jelezte. Ebben a vizsgálatban a heterológ szomatotropin bioaktivitását becsüljük fel különféle ismert szomatotropin-anyagokkal (pl. bovin- vagy porcin hipofízis szomatotropinnal) összehasonlítva, a hipofízis-irtott patkányok által a váltakozó mennyiségű beadott anyagra mutatott súlygyarapodás mennyiségeit összevetve. A testsúlynővekedés regressziós meredekségeit a szóban forgó szomatotropin anyag adagjaival szemben összehasonlítjuk az ismert standarddal (azaz hipofízis-eredetű anyaggal) és kiszámítjuk a relatív bioaktivitást U(egység)/mg növekedési hormon formában a heterológ szomatotropin anyaghoz. A jelen találmány által körvonalazott eljárás szerint szolubilizált és helyreállított, majd ezt követően tisztított N-metionil-bovin szomatotropint ez után tejelő teheneknek adtuk be. Azok a tehenek, amelyeknek ilyen készítményt adtunk be, 10-40 súly%-kal több tejet termeltek, mint a kontroll állatok, lásd Eppard és munkatársai: .The Effect of Long-term Administration of Growth Hormone on Performance of Lactating Dairy Cows' (A növekedési hormon hosszú időn át végzett bedásának hatása a tejelő tehenek tejképzódési teljesítményére'). Proceedings of the 1984 Cornell Nutrition Conference. Az ez után következő példák a jelen találmány gyakorlatának jobb megvilágítását foglalják magukban. Meg kell érteni azonban, hogy ezek a példák csak az illusztráció céljait szolgálják, és semmiképpen sem szándékoznak korlátozni a jelen találmány oltalmi körét. 1. példa A jelen találmányt E. coli-ban kifejezett N-metionil-bovin szomatotropin (MBS) szolubilizálásával demonstráljuk, az E. coliban való kifejeződést általában leírták Seeburg és munkatársai: DNA 2(1), 37-45 (1983). Az egyes lépések részleteit megtalálhatjuk a következő irodalmi helyeken: Goeddel és munkatársai: Nature, 281 (1979 október); DeBoert és munkatársai: Promoters: Structure and Function, 462-481, Kiadó: Praeger Scientific Publishing Co. (1982); és Miozzari és munka-' társai: J. Bacteriology, 133, 1457-1466 (1978). A kinyert sejteket kétszeres átengedéssel zúzzuk össze Manton-Gualin homogenizátoron keresztül. Az MBS-t tartalmazó fénytörő testecskéket kiülepitjük a homogenizált oldatból' kis sebességű centrifugálással. A felülúszót elöntjük, a fénytörő testecskéket újra szuszpendáljuk, mossuk, és újra üledékbe viszszük. A felülúszót ismét elöntjük, amikor is ' lényegében tiszta fénytörő testecske készítmény marad vissza. A fentebb leirt módon készített fénytörő testecskéket különböző koncentrációjú kar- 5 bamid-oldatoknak tesszük ki, különböző pH szinteken 25 °C hőmérsékleten. Minden pufferolt oldat 100 mmól/liter trisz-bózist tartalmaz. A pH beállítását HC1 hozzáadásával hajtjuk végre. A végső fénytörő testecske kon- 10 centráció mintegy 4 mg/ml oldat. A feloldódás mértékét spektrofotometriásán határozzuk meg, feltételezve, hogy a fénytörő testecskék teljesen fehérje-jellegűek, és 0,68 extinkciós együtthatót (£) alkalmazva 277 nm-nél és 15 1 cm fényútnál, 1 mg/ml fehérje-koncentrációt ennek véve. A kiindulási koncentrációt spektrofotometriásán határozzuk meg és teljesen oldott mintánál. A fentebb leirt kísérlet eredményeit az 1. ábrában mutatjuk be. Ezek 20 az adatok is alátámasztják a nem várt felfedezést, hogy a pH beállítása alkalikus körülmények közt lényegesen megnöveli a szolubilizálás mértékét. 25 2. példa Az 1. példában leírt folyamatot követjük azzal a különbséggel, hogy a hőmérsékletet 30 4 °C hőmérsékleten tartjuk fenn és a pH-t beállítjuk mind savas, mind alkalikus szintekre. Amint az 1. példánál, minden pufferolt oldat 100 mmól/liter triszbázist tartalmaz. A pH beállítást savas szintekre ecetsav hozzá- 35 adásával hajtjuk végre. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 2. ábrában mutatjuk be. Az 1. és 2. ábrákat összevetve állandó karbamid-koncentréciónál és adott pH-nál azt mutatjuk ki, hogy a szolubilizálódás növekedé- 40 sét kapjuk a csökkentett hőmérsékleten (4 °C) a szobahőmérséklethez (25 °C) viszonyítva. 45 .A ' összehasonlító példa MBS-t tartalmazó fénytörő testecskéket készítünk az 1. példában leírt módon. A fénytörő testecskéket 10 mól/liter karbamid- 50 -oldattal keverjük össze pH beállítás nélkül, úgy, hogy a végső fénytörő testecske koncentráció mintegy 5,0 mg/ml legyen. Az oldatot összekeverjük és hagyjuk kiegyensúlyozódni egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A 55 szolubilizálódás mértékét csupán 2,9 mg/ml-nek határozzuk meg a fentebb leírt spektrofotometriás módszerrel. A fénytörő testecskék kiindulási koncentrációját ahhoz elegendő karbamid oldat hozzáadásával határozzuk 60 meg, hogy a fénytörő testecskék teljesen feloldódjanak, a teljesen feloldott oldatot spektrofotometriásán mérve és megfelelő hígításra beállítva. 10
