201093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére
.B ‘ összehasonlító példa 17 HU 201093 B 18 Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytörö testecskéket vizes, 8.0 mól/literes karbamid-oldattal keverünk össze pH beállítás nélkül, úgy, hogy a végsó fénytörő testecske koncentráció mintegy 5.0 mg/ml legyen. Az oldatot összekeverjük és hagyjuk kiegyensúlyozódni egy éjszakán 4 °C hómérsékleten. A szolubilizólódás mértékét 2,4 mg/ml-nek határozzuk meg a fentebb leírt spektrofotometriás módszerrel. A fénytöró testecskék kiidulási koncentrációját ahhoz elegendő karbamidoldat hozzáadásával határozzuk meg, hogy a fénytóró testecskék teljesen feloldódjanak, a teljesen feloldott oldatot spektrofotometriásán mérve és megfelelő hígításra beállítva. 3. példa Az 1. példában leirt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytőró testecskéket öszszekeverünk nem pufferolt, vizes 4,5 mól/literes karbamid oldattal olyan módon, hogy a fénytőró testecske koncentráció mintegy 66 mg/ml legyen. Az oldt pH-ját 7-ről 11-re állítjuk be hig NaOH-val. Az oldat kitisztulása jelzi a teljes szolubilizálást. A fénytőró testecske koncentrációt 66 mg/ml-nek az 1. példában leirt spektrofotometriás elemzéssel határozzuk meg. 4. példa Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytőró testecskéket szolubilizálunk vizes, 7,5 mól/literes karbamid-oldatban, amely 100 mmól/liter triszt tartalmaz 10,5 pH-nál. A karbamid-koncentrációt különböző szintekre állítjuk be 100 mroól/literes trisz hozzáadásával és a teljes fehérjekoncentrációt mintegy 1 mg/ml értéken tartjuk (egy teljesen feloldott minta spektrofotometriás elemzésével meghatározva) a megfelelő karbamid oldat bizonyos térfogatának hozzáadásával. A feloldott MBS-t oxidálódni engedjük az oldatot levegő hatásának téve ki, keverés körülményei között 24 órás időtartamra. Az eredményeket grafikusan a 3. ábrában mutatjuk be. Az MBS monomer kitermelést mint a teljes MBS tartalom súlyszázalékát jelezzük. Amint a 3. ábrából látható, optimális helyreállítási hatékonyságot nyertünk mintegy 4,5 mól/liter karbamid-koncentrációnál. 5. példa A 4. példában leirt folyamatot követve MBS-t tartalmazó fénytőró testecskéket szolubilizálunk vizes, 7,5 mól/literes karbamid-oldatban, amely trisz-re 100 mmól/literes, pH 10,5-nél. A szolubilizálást követően az oldatot 4,5 mól/liter karbamid-tartalomra hígítjuk 100 mmól/literes trisz-oldattal és a pH-t különböző szintekre állítjuk be 10,5 és 8,5 közé. Ezeket az egyedi kísérleti tételeket oxidálódni hagyjuk olyan módon, hogy levegő hatásának tesszük ki keverés körülményei között 24 órán át. Az MBS monomer és oligomer tartalmat HPLC-vel meghatározzuk. Bár az eredmények viszonylag lapos választ jeleznek a helyreállítási hatékonyságban az oldat pH-jával szemben az oxidálás során, az irányzat az, hogy a nagyobb pH-knál nagyobb a hatékonyság. Ezen túl a bázissal katalizált oxidáció gyorsabban halad előre az alkalikusabb pH-knál. 6. példa Mintegy 150 ml, 1. példában leirt módon készített fénytőró testecske készítményt adunk mintegy 850 ml vizes, 5,3 mól/literes karbamid-oldathoz 4 °C hőmérsékleten. Az Így kialakult 4,5 mól/literes karbamid-oldatot pH 11 értékre állítjuk 50 súlyX-os NaOH oldattal. A fénytőró testecskék teljesen feloldódnak, mintegy 12,4 mg/ml teljes MBS koncentrációt eredményezve. Az oldatot 4 °C hőmérsékleten kevertetjük egy éjszakán át, hogy oxidáljuk az MBS-t. Az oxidált oldat HPLC elemzése azt jelzi, hogy az MBS monomer kitermelés hatékonysága mintegy 80%. 7. példa N-metionil porcin szomatotropint (MPS) fejezünk ki E. coli-ban, az 1. példában felsorolt referenciák általános kitanításait alkalmazva. Az MPS-t tartalmazó fénytörő testecskék korábban leírt módszert alkalmazva végzett kinyerését kővetően ezeket 4 °C hőmérsékleten 7,5 mól/literes karbamid-oldatban szolubilizáljuk, amely 90 mmól/liter triszt is tartalmaz (pH 11,0). Milliliterenként 113 mg (nedves súly) fénytörő testecske üledékét oldunk fel a fenti karbamid-oldatban. A mintákat 90 mmól/liter trisz-szel és/vagy karbamiddal hígítjuk, hogy 4,5 mól/liter és 2,0 mól/liter karbamid-koncentrációkat nyerjünk 4 mg/ml MPS-koncentrációval, a fénytörö testecske üledék nedves súlyára alapozva. A mintákat oxidálódni hagyjuk olyan módon, hogy egy éjszakán át levegőnek tesszük ki kevert körülmények között. A HPLC-vel végzett mérés 3 mól/liter karbamid-koncentrációnál jelez optimális MPS monomer kitermelést. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
