201085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfortartalmú vegyületek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
15 HU 201085 B 16 leszterinszintézis inhibitorokat megvizsgáltuk, hogy ugyancsak inhibitorai-e a kötőszöveti tenyészetben végbemenő koleszterinszintézisnek. a) Emberi bőr kőtószöveti sejtjeinek tenyészete Emberi bőr kötőszöveti sejtjeit (7-27 alkalommal átoltott) Eagles-féle minimál táptalajon, amely 10% magzati borjúsavót tartalmaz, szaporítjuk. Minden egyes kísérlethez törzstenyészetet készítünk, amelyet tripszinnel kezelünk, hogy az egysejtréteget diszpergáljuk, majd sejtszámlálás után a két mililiterenként 5xl05 sejtet tartalmazó tenyészetet szétterítjük egy 35 mm-es tenyésztő tálban. A tenyészetet ezután 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxid és 95% nedvesített szobalevegőből álló atmoszférában inkubáljuk 18 óra hosszat. A koleszterin bioszintéziséért felelős enzimeket úgy indukáljuk, hogy eltávolítjuk a savótartalmú tápoldatot, az egysejtréteget mossuk, és 1,0 ml, 1% zsírsavaktól mentes szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó Eagle-féle minimál tápoldatban további 24 órán át inkubáljuk a tenyészetet. b) (14C) Ecetsav beépülése a koleszterinbe Az indukált kötőszöveti sejttenyészetet Earle-féle minimál tápoldattal mossuk. A vizsgálandó anyagot dimetil-szulfoxidban, vagy dimetil-szulfoxid és Earle-féle minimál tápoldat 1:3 arányú elegyében feloldjuk (a dimetil-szulfoxid végső koncentrációja a sejttenyészetben nem haladja meg az 1%-ot), az oldatot a tenyészethez adjuk, amelyet ezután 37 °C hőmérsékleten, 5% szén-dioxidot és 95% nedvesített szobalevegőt tartalmazó atmoszférában, 30 percen át előinkubálunk. A vizsgálati anyaggal végzett előinkubálás után nátrium-! l-HC)acetátot (2,0 wCi/ml, 58 uCi/mmól) adunk a tenyészethez, és folytatjuk az inkubálást még négy óra hosszat. Ezután a tápoldatot eltávolítjuk, és az egysejtréteget (200 ug fehérje tenyészetenként) 1 ml vízbe kaparjuk. Az elroncsolódott sejtekből a lipi— deket kloroform-metanol-eleggyel extraháljuk, követve a májsejtszuszpenzió feldolgozásával kapcsolatban leírtakat. A szerves fázist nitrogéngáz alatt beszárítjuk és a maradékot újból felszuszpendáljuk 100 wl kloroform-metanol 2:1 arányú eleggyel. A teljes mintát felcsöppentjük szilikagél vékonyréteg-kromatográfiás lemezre, és elvégezzük az analízist a májsejtes kísérletnél leírt módon. A koleszterin szintézisét gátló hatást úgy értékeljük ki, hogy meghatározzuk a koleszterinbe beépült nyomjelző nukleid százalékos mennyiségét a vizsgálandó minta jelenlétében, illetve anélkül. Két vagy több kísérlet mérési eredményeiből megszerkesztjük a dózis-hatás diagramot, és leolvassuk az Iso értéket. A 95%-os megbízhatósági intervallu10 mot ugyancsak a dózis-hatás diagramból számítjuk. Jelen találmány tárgyaként tekintjük továbbá mindazoknak a gyógyszerészeti készítményeknek az előállítását, amelyek a gyógyszerészeiben szokásos hordozó- és hígítóanyagokon kívül a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületekból legalább egyet tartalmaznak. A megfelelő gyógyszerészeti készítményt általánosan ismert szilárd vagy folyékony hordozó- és higitóanyagok, illetve más gyógyszeradalékok felhasználásával állítjuk elő, amelyek alkalmasak arra, hogy a kívánt kezelési módnak megfelelő gyógyszerformát elkészítsük. A vegyületeket bejuttathatjuk a szervezetbe orálisan - például tabletta, kapszula, granulátum vagy por formájában - vagy parenterálisan, injekciós készítmény formájában. A különböző adagolási formák hatóanyag-tartalma adagonként 1 és 2000 mg között lehet. A beadandó dózis függ az egységnyi dózistól, a tünetekből, továbbá a beteg korától és testtömegétől. Az (I) általános képletű vegyületeket más, a koleszterin bioszintézisének gátláséra javasolt gyógyszerekhez - ilyen például a lovastatin - hasonlóan alkalmazhatjuk emlősök, beleértve az embert, kutyát, macskát és más hasonlókat, kezelésére. Ennek megfelelően, a találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket beadhatjuk egyetlen, 4-2000 mg hatóanyagot tartalmazó dózisban, vagy egyénre szabott dózisokban, például naponta négyszer 1-tól 100 mg-ig terjedő adagban, előnyösen 4-200 mg-ot, napi négy 0,5 és 50 mg közötti adagban. Végezhetjük továbbá a kezelést a vegyületeket hosszú idő alatt szabaddá tevő gyógyszerformával is. A találmány előnyös kiviteli módjait szemléltető eljárási változatokat mutatjuk be a következő példádk sorén. A példák leírásában, ha más jelölés nem utal rá, a hőmérsékletet °C-ban adjuk meg. A flash-kromatográfiás elválasztást Merck 60 vagy Whatmann LPS-I szilikagélen végeztük. A fordított fázisú kromatográfiéhoz CHP-20 MCI gél gyantát - a Mitsubishi Ltd. gyártmánya - alkalmaztunk. 1. példa Lítium-(SÍ-{4-[/{2-(4-fluor-3-metil-fenilh4,6-dimetil-benzil}-oxi/-metoxi-foszfonil ]-3-hidroxi-bu tirá t} A) N-(2,4-Dimetil-benzilidén)-fenil-amin Irodalom: Merck, 4 375 475 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 39. oldal 6,97 ml (50 mmól) frissen desztillált 2,4- -dimetil-benzaldehid (Aldrich), 4,56 ml (50 mmól) desztillált anilin (Aldrich) és 80 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
