201057. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-fenil-3-(piperazinil-alkil)-1H,3H-pirimidin-2,4-dion-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 201057 B 12 A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket számos farmakológiai kísérletnek vetettük alá, és ezek szerint a vegyületek értékes terápiás hatásúak. Az egyik vizsgálat során patkány agykamrájában lévő 5-HTu típusú szerotoninerg-receptorokhoz való affinitását vizsgáltuk. Gozlan és munkatársai a Nature-ben (1983) 305, 140-142 ismertették a jelzett[3H]-8-hidroxi-di-2-n-propil-amino-tetralin (a következőkben [3H]-8-OH-DPAT-ként szereplő) specifikus kötődését az 5-HT-u receptorokhoz. Ezt a jelzett specifikus kötődést a találmány szerinti vegyületek kiszorítják. A kísérleteket Sprague-Dawley törzshöz tartozó 160-200 g hímpatkányokkal végeztük. Az állatok lefejezése után az agyukat kiemeltük és az agykamrát kimetszettük. A szövetet Ultra-Turrax Polytron készülékben 30 másodpercen keresztül a maximális sebesség felével homogenizáltuk 10 térfogatnyi menynyiségű 50 mmól trisz-pufferoldattal, amelynek a pH-értékét hidrogén-klorid-oldattal, 7,4-re állítottunk be (vagy milliliterenként 100 mg friss szövet). A homogenizált szövetet háromszor mostuk 4 °C-on, mégpedig úgy, hogy minden esetben 10 percen át centrifugáltuk (48 000 xg), és a szuszpenzióban lévő üledéket friss, lehűtött pufferoldatba helyeztük. Végül az utolsó szuszpenzióban lévő üledéket pufferoldatba helyeztünk, úgy, hogy 100 mg kiindulási szövet legyen 50 mmólos pufferoldat 1 ml-ében. Ezt követően 37 °C-on inkubáltuk 10 percen át. A 3H -8-OH-DPAT kötődését (1 nmól) 100 pl membrán szuszpenzió inkubálásával határoztuk meg, amelynél a pufferoldat 1 ral-e 10 pmól pargylint és 3 pmól paroxetint tartalmazott. 15 percen át 37 °C-on való inkubálás után a membránokat Whatman GF/B szűrőn való szűréssel visszanyertük, és háromszor kb. 5-5 ml jeges pufferoldattal mostuk. A szűrőket szcintillációs folyadékkal extraháltuk, és a radioaktivitást szcintigráfiás eljárással mértük. A [3H]-8-OH-DPAT specifikus kötődését, mint a szűrőn maradó radioaktivitás mennyiségét határoztuk meg, és amelyet 10 pmólos 5-hidroxi-triptaminban való koinkubálással meggátolhatunk. 1 nmól koncentrációjú [3H]-8-OH-DPAT specifikus kötődése a szűrőn visszanyert ossz-radioaktivitás 90%-át képviseli. A vizsgált vegyületek minden egyes koncentrációja esetén meghatároztuk a [3H]-8-OH-DPAT kötődésének %-os gátlását, majd az ICso koncentrációját, vagyis azt a koncentrációt, amely a kötődés 50%-át kiszorítja. A találmány szerinti vegyületek ICso értéke 0,001 és 0,1 pmól közötti. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeknek azt a hatásét is megvizsgáltuk, amellyel a patkányagykéregben lévő szterotoninerg receptorokban (5-HT2) spiroperidol kötődését kiszorítja. A kísérlethez a patkényagyat kiemeltük, az agykérget kimetszettük és 0 °C-on 10 térfogat mennyiségű elegyben homogenizáltuk, amely elegy literenként 7,4 pH értékű 50 mmól trisz/HCl pufferoldatot tartalmaz. A homogén elegyet (40 000 xg) centrifugáltuk 10 percen át, amelyet kétszer megismételtünk, az üledéket kivettük és a fenti puffer-eleggyel szuszpenziót készítettünk, homogenizáltuk ismét és centrifugáltuk. Befejezésül az üledéket úgy hígítottuk, hogy a fenti pufferoldat 1 ml-e 100 rag nedves szövetet tartalmazzon. Ekkor a szövetet előzetes inkubálésnak etettük alá 10 percen át, 37 °C-on 10 pmól/1 pargylin jelenlétében, majd 20 percen át 37 °C-on 0,3 nmól/1 koncentrációjú ^-spiroperidol jelenlétében (fajlagos aktivitása: 25,6 Ci millimóíonként), majd a vizsgálandó vegyületek jelenlétében, 0,0001 és 100 pmól/ /liter közötti koncentrációnál. Körülbelül 1 ml anyagot kiemeltünk és vákuumban szűrtük, a szűrőt 2 x 5-5 ml hideg pufferoldattal mostuk majd száritottuk. A radioaktivitást toluolban mértük 5 g/liter 2,5-difenil-oxazol (PPO) 0,1 g/1 l,4-bisz(5-fenil-oxazol-2-il)-benzol (PPOP) jelenlétében. A találmány szerinti vegyületek kiértékelése céljából a 3H-spiroperidol specifikus kötődése %-os gátlásának görbéjét ábrázoltuk a kötődést kiszorító vegyület koncentrációjának függvényében. Grafikusan ábrázoltuk az IC50 koncentrációt, vagyis azt a koncentrációt, amely a specifikus kötődés 50%-át gátolja. A fajlagos kötődést, mint az 5-HT2-n 100 pmól/liter által kiszorított kötődést határoztuk meg. A találmány szerinti vegyületek nagyobb részének ICso koncentrációja 0,01 és 0,5 pmól közötti. A vegyületek 5-HTu és 5-HT2 típusú szerotonin-receptorokra kifejtett hatását a következő táblázat szemlélteti (IC50, mM): 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8
