200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B 17 18 search Laboratories, Inc., USA) alkalmazva, és együtt kezeljük 56 ng pBR 322 plazmiddal, amelyet Pst I-el emésztettünk és dezoxi G gyökkel kiegészítettünk. Az így együtt kezelt (összeforrasztott) keveréket E. coli K-12 törzsbe (HB101, ATCC 33694) 5 iktatjuk be, hogy transzformáljuk a törzset. A művelet eredményeként 12 000 transzformánst nyerünk. 10. lépés A nyúl TNF részleges aminosav-szekvenciája A 2. lépésben részlegesen tisztított nyúl TNF-et (aktivitás: 5.107 egység (SDS-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetjük alá, mint az 5. lépésben. A gél részeit megfestjük Coomassie Brilliant Blue festékkel. A 17000 molekulasúlynak megfelelő helyzetnél levő csíkokat kivágjuk a gélből, és 1%-os ammónium-bikarbonáttal extraháljuk. Mintegy 180 TNF-et nyerünk ki, mint fehérhét. 150 |xg kinyert fehérjét feloldunk 75 p,g 1%-os ammónium-bikarbonátban, ezt követi 3 |xg tripszin hozzáadása (gyártja és forgamazza: Worthington Biochemical, USA). A keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át. A keveréket ezután frakcionáljuk nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás oszlop segítségével, amely töltő anyagként Cosmosil 5C8-at (gyártja és forgalmazza: Nakarai Chemical, LTD., Japán) tartalmaz, ezáltal tripszinnel emésztett fragmenseket nyerünk. A nagy mértékben tisztított TNF-et és a tripszinnel emésztett fragmenseit azután sómentesítésnek vetjük alá Sephadex G-25 oszlop segítségével, majd fagyasztva szárítjuk. R.M. Hewick és munkatársai módszere szerint (lásd: J. Bioi. Chem., 256. kötet, 7990-7997 oldal, 1981) a tisztított TNF-et és összes tripszinnel emésztett fragmenseit Edman lebontásnak vetjük alá az N-terminálistól. Az egyes lépésekben felszabaduló PHT-aminosavakat szokásos módon elemezzük nagy felbontású kromatográfiával, SP8100Model-en (gyártja és forgalmazza: E.I. Dupont, USA) alkalmazva. Végeredményben úgy találjuk, hogy a TNF N-terminális aminosavszekvenciája a következő: Ser-Ala-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp- Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Ala-Asn-Gln-Val-GIu -Gln-Leu-Gln-A tripszinnel emésztett fragmensek egyikének a kövektező az N-terminális aminosav-szekvenciája: Glu-Thr-Pro-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-Met-Ala- 11. lépés Oligodezoxi-nukleotid minta szintézise Az mRNS bázisszekvenciájával, amelyet a 10. lépésben nyert nyúl TNF aminosav-szekvenciából következtettünk ki, komplementer oligodezoxi nukleotidokat szintetizáljuk a javított foszfortriészter módszer szerint, amelyet a jelen találmány fel- 10 találói már leírtak (Ito és munkatársai: Nucleic Acid Rés. 10, 1755-1769 (1982)]. Az oligodezoxinukleotidok elkészítésénél a nyúl TNF-aminosavszekvenciájából becsült 128 tagú oligodezonnukleotidot 5 csoportba osztályozzuk, nevezetesen 16-os, 15 16-os, 32-es, 32-es és 32-es csoportokba, és a megfelelő csoportok oligodezoxinukleotidjainak keverékeként szintetizáljuk. A megfelelő csoportok nyert oligodezoxinukleotidjait védőcsoportjaiktól megszabadítjuk szokásos módszerek szerint és tisz- 20 títjuk oszlopkromatográfiával Sephadex G-50-et (gyártja és forgalmazza: Pharmada Fine Chemicals, Inc., Svédország) alkalmazva, és elektroforézissel 20 súly%-os poliakrilamid-gélen, amely 7 mól/liter karbamidot is tartalmaz, és oszlopkroma- 25 tográfiával DE52-t (gyártja és forgalmazza: Wathman Ltd, USA) alkalmazva. A megfelelő csoportok így nyert oligodezoxinukleotidjait 0,1 mmól/literes Trisz-EDTA pufferoldattal szemben dializáljuk. A megfelelő csoportok tisztított oligodezoxinuk- 30 leotidjainak mindegyikét megjelöltük T4 polinukleotid kinázt (gyártja és forgamazza: Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) és -y-r-adenozintrifoszfátot alkalmazva a szokásos módszer szerint, majd oszlopkromatográfiával tisztítjuk, DE 52-t 35 (gyártja és forgalmazza: Wathman Ltd. USA) alkalmazva. A radioaktív anyagot a megfelelő csoportok egyes oligodezoxinukleotidjaiba kb. 3.108 cpm/\Lg mennyiségben építjük be. A megfelelő csoport keverékei formájában nyert egyes oligodezo- 40 xinukleotid mintákat az 1. Táblázatban bemutatottak szerint jelöljük. A nyúl TNF aminosav-szekvenciájának egy részét, a nyúl TNF aminosav-szekvendájából becsült mRNS bázis-szekvendáját és a megfelelő csopor- 45 tok szintetikus oligodezoxinukleotid mintáinak bázisszckvenciáit az 1. Táblázatban mutatjuk be. 1. Táblázat Aminosav Karboxi Aminoszekvencia terminális .... Alá Met Pro Glu Glu ....terminális mRNS 3’.... XCG GTA xcc YAG YAG.., ...5’ MH minta 5’ GC CAT MGG MTC GGC MTC MTC 3’ MI minta 5’ GC CAT NGG MTC GGC MTC MTC 3’ MJ minta 5’ GC CAT XGG MTC AGC MTC MTC 3’ MK minta 5’ GC CAT XGG MTC CGC MTC MTC 3’ ML minta 5’ GC CAT XGG MTC TGC MTC MTC 3 Megjegyzés: X jelentése A, C, G vagy U ribonukleinsav gyök, Y jelentése A vagy G ribonukleinsav gyök, M jelentése T vagy C dezoxiribonukleinsav gyök, N jelentése A vagy G dezoxiribonukleinsav gyök, Z jelentése A, C, G vagy T dezoxiribonukleinsav gyök. 10
