200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B 12. lépés Az oligonukleotid vizsgálata A TNF-et termelő sejt mRNS-ét, amelyet a 6. lépés szerint nyertünk, 1 mól/liter glioxált, 10 mmól/liter NaH2P04-et és 50 tf.% dimetil-szulfoxidot tartalmazó oldattal kezeljük 50 °C hőmérsékleten 60 percen át, majd frakcionálásnak vetjük alá, gélelektroforázist alkalmazva 1,1 súly%-os agaróz gélen. A frakcionált mRNS-t egy elektroforézis-típusú transzfer-itatós berendezés (transfer blotting apparatus)(gyártja és forgamazza: Bio Rád, USA) szűrőjére visszük a gyártó cég használati utasítása szerint. Ezúton a berendezés szűrőjén levő mRNS-t SxDenhardt oldattal kezeljük, amely tartalmaz még 5xSSC oldatot és 150 pg/ml denaturált lazac sperma DNS-t, 65 °C hőmérsékleten 2 órán át, majd 5xDenhardt oldattal kezeljük, amely tartalmaz még 1.107 cpm/ml jelzett oligodezoxinukleotidot és 5xSSC oldatot, 50 °C hőmérsékleten 2 órán át. A fentiek szerint nyert szűrőt 6xSSC oldattal mossuk egymás után négyszer, szobahőmérsékleten, majd 40 #C, 50 °C és 60 °C hőmérsékleten. XAR-5 röntgenfilmet (gyártja és forgamazza: Eastman Kodak Company, USA) teszünk ki a szűrőről és jövő sugárzásnak. Ennek eredményeképpen azt találjuk, hogy az MJ mintának jelölt oligodezoxinukleotid hibridizálódik legerősebben az mRNS-el, azt mutatva meg, hogy az mRNS-re teljesen komplementer bázisszekvenciával rendelkező oiigonukleotidot az MJ mintával jelölt oligodezoxinukleotid tartalmazza. 13. lépés A nyúl TNF gén klónozása A (2) irodalmi hivatkozásban, a 162. oldalon leírt eljárással összhangban a 9. lépésben nyert transzformánsokat cellulóz szűrőre visszük és a transzformánsok DNS-ét hibridizáljuk a 12. lépésben kiválasztott jelzett oligonukleotiddal (MJ minta) ugyanolyan körülmények között, mint a 12. lépésben (telep hibridizálás). Az itt említett folyamatban 49 olyan telepet, amely erősen hibrizálódott a jelzett oligonukleotidokkal (MJ minta), választunk ki 19 és ismét rögzítjük egy másik nitrocellulóz szűrőre. Ezután, 49 telepet alkalmazva, további hibridizálást hajtunk végre, 9 telepet választva ki, amelyek erősebben hibrizálódnak a jelzett oligonukleotidokkal 5 (MJ minta). Az (1) irodalmi helyen, a 6. oldalon leírt gyors plazmidelkülönítő módszerrel összhangban kb. 5 ixg plazmidot nyerünk a kilenc telep mindegyikéből. A nyert plazmidok mindegyikét elhasítjuk a 10 következő restrikciós enzimeket alkalmazva: Pst I, Tag I, Rsa I és Pvu II (mindegyiket a Bethesda Research Laboratories, Inc., USA gyártja és forgalmazza), a hasítást a gyártó cég használati utasításában leírt eljárás szerint végezve. Ezt követi az elekt- 15 roforézis 1 súly%-os agaróz gélen kivitelezve. Ezután a megfelelő restrikciós enzimekkel végzett hasítással nyert fragmenseket összehasonlítjuk hosszúságuk szempontjából. Az eredmények azt sugallják, hogy a kilenc te- 20 lepnek megfelelő mind a kilenc törzs rendelkezik a Pvu II és Rsa I hasítással nyert és mintegy 50 bp-t tartalmazó fragmens bázisszekvenciájával és a kilenc törzs legtöbbje rendelkezik az Rsa I hasítással nyert és kb. 200 bp-t tartalmazó fragmens bázisz- 25 szekvenciájával. Más szavakkal, az eredmények azt sugallják, hogy a kilenc törzs részben közös szekvenciával rendelkezik. A restrikciós enzimekkel végzett elemzés eredményeit az 1. ábra mutatja be. A 2. táblázatban jelzett plazmidokat tartalmazó 30 hét törzset külön-külön tenyésztjük 2 ml LB tápközegben, amely még 10 |jLg/ml tetraciklint is tartalmaz, ameddig az oldat optikai sűrűsége el nem éri a 2. táblázatban megadott értékeket, majd a tenyészetet centrifugáljuk, hogy a különböző törzseket 35 kinyerjük. A kinyert törzsek mindegyikét külön-külön 2 ml fiziológiás sóoldathoz adjuk és ultrahangos kezeléssel szétzúzzuk. Az így nyert oldatot centrifugálásnak vetjük alá és a nyert felülúszó L sejtek elleni citotoxikus aktivitását megmérjük. Az ered- 40 ményeket a 2. Táblázat mutatja be. Vakpróbaként ugyancsak a fenti eljárást ismételjük meg, pBR 322 plazmidot tartalmazó törzset alkalmazva. Ezeket az eredményeket is a 2. Táblázat mutatja be. 20 2. Táblázat Plazmid Az összeforrott bázispá rok száma OÖ60 Citotoxikus aktivitás L-sejtek ellen (egység/ml) pB 2-2 1400 1,369 35 pB2-3 800 1,605 pB 2-7 1060 1,364 pR9 1550 1,618 pR 12 1400 1,438 15 pR 18 1850 1,438 pR25 1350 1,514 pBR 322 0 1,677 Az L sejtek elleni citotoxikus aktivitást meg lehet szüntetni anti-TNF antitesttel, de nem lehet megszüntetni normál egér szérummal. Ez azt mutatja, hogy a fentebb említett kilenc telep mindegyike rendelkezik olyan plazmiddal, amely TNF-et kódoló oligodezoxinukleotidot tartalmaz. 14. lépés A nyúl TNF-et kódoló DNS bázisszekvenciájának meghatározása 11
