200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B letet kódoló DNS kifejeződésének megvalósítására abból a célból, hogy a fiziológiailag aktív vegyületet előállítsuk. Amikor gazdaszervezetként Escherichia coli-t alkalmazunk alkalmas gazdaszervezetként meg lehet említeni az E. coli különböző mutáns-törzseit, pl. a HB101 (ATCC 33694), C600K (ATCC 33955), D1210, RRI (ATCC 31343), MC1061, LE392 (ATCC 33572), JM101 (ATCC 33876), JM83, és k 1776 (ATCC 31244). Amikor E. coli gazdaszervezetet alkalmazunk, meg lehet említeni alkalmas vektorként a plazmidokat, pl. pBR322, pBR325, pBR327, pUC3, pUC9, pMB9 (ATCC 37019), pJB8 (ATCC 37074) és pKC7 (ATCC 37084) plazmidokat, X-fágokat, pl. a Xgt és XB fágokat, és egyéb fágokat, pl. Charon 4A és M13 fágokat. Hogy az E. coli sejtben termelt aktív vegyületet nyerjük, az E. coli promotoijaiból kiválasztott promotorokat és fág géneket alkalmazhatunk. Ilyen megfelelő promotorra példák lehetnek a laktóz lebontó enzim (LAC) génje, ennek UV5 mutáns, a penicillináz (BLA) génje és a triptofán szintetáz (TRP) génje, a X fág Pl promotor és a tac promotor, amely a triptofán-szintetázzal és laktóz lebontó enzimmel fuzionált promotor. Amikor Bacillus subtilist használunk gazdaszervezetként, alkalmas gazdaszervezetként meg lehet említeni a BD 170 törzset (ATCC 33608), BR151 törzset (ATCC 33677) és MI112 törzset (ATCC 33712). Amikor B. subtilis gazdaszervezetet alkalmazunk, meg lehet említeni alkalmas vektorként a plazmidokat, pl. a pC194 (ATCC 37034), pUBllO (ATCC 37015), pSA2100 (ATCC 37014) és pE194 plazmidokat. Ezen kívül amikor Bacillus subtilis gazdaszervezetet alkalmazunk, alkalmas promotorként meg lehet említeni a klóramfenikol-acetilező enzimhez (CAT), penicillinázhoz és anti-eritromicinhez szolgáló géneket. Amikor élesztőket használunk gazdaszervezetként, alkalmas gazdaszervezetként meg lehet említeni a Saccharomyces cerevisiae törzseit, ilyenek pl. az RH218 (ATCC 44076), SHY1 (ATCC 44769), SHY3 (ATCC 44771), D131A, 483 és 830 törzsek. Amikor élesztő gazdaszervezetet alkalmazunk, meg lehet említeni alkalmas vektorként a plazmidokat, mint pl. az YEpl3 (ATCC 37115), YEp6, YRp7 és YIp5 plazmidokat. Ezen kívül amikor élesztő gazdaszervezetet alkalmazunk, alkalmas promotorként meg lehet említeni a savas foszfatázhoz, alkohol-dehidrogenézhoz (ADHI), triptofánszintetázhoz (TRP), foszfoglicerát-kinázhoz (PGK), citokróm B-hez (COB) és aktinhoz tartozó géneket. Az így készített transzformánsokat nagy léptékben tenyésztjük szokásos módszer szerint, hogy a kívánt, fiziológiailag aktív vegyületet előállítsuk. Ezután a tenyészet fclülúszóját vagy a sejtkivonatot összegyűjtjük, hogy nyers, fiziológiailag aktív vegyületet nyerjünk. A fentebb említett módszerek bármelyikével előállított nyers, fiziológiailag aktív vegyületet tisztíthatjuk az alább idézett hagyományos biokémiai technikákkal egyedül vagy kombinációban, hogy egy tisztított vizes, fiziológiailag aktív vegyület oldatot nyerjünk, amelyet liofilezünk, hogy tisztított, 7 fiziológiailag aktív vegyület port nyerjünk. Mint az aktív vegyület tisztításához alkalmas biokémiai technikát meg lehet említeni pl. a kisózási technikát, amelyben ammóniumszulfátot alkalmazunk, az ioncserélő kromatográfíát, amelyben anioncserélő gyantát alkalmazunk, a gélszűrési technikát és az elektroforézises technikát. Amint az aktív vegyület tisztasága növekszik a tisztításra szolgáló fenti technikák gyakorlatba vételével, felismerhető, hogy az aktív vegyület fokozatosan instabillá válik. így pl. a fiziológiailag aktív vegyület egy mintája, amelyet úgy tisztítottunk, hogy fajlagos aktivitása 500 000 egység/mg (a fajlagos aktivitást úgy fejezzük ki, mint az aktivitás egységeit í mg fehéijére számítva; az aktivitás egységét később határozzuk meg), meglehetősen instabil, amint ez a példákban levő adatokból látható. Még azokban a mintákban is, amelyeknek fajlagos aktivitása kisebb, mint 500 000 egység/mg, tapasztalható a megfelelő aktivitás csökkenése bizonyos mértékig, amikor azokat tároljuk vagy fagyasztásnak, felengedtetésnek, liofilezésnek és más műveleteknek vetjük alá. Következésképpen a jelen találmány az olyan fiziológiailag aktív vegyületek stabilizására irányul, amelyet nagy mértékben tisztítottak és ezáltal instabillá tettek. A jelen találmány szerint stabilizálandó aktív vegyület lehet oldat vagy por formájában. Előnyös azonban, ha a stabilizálandó aktív vegyület oldat formájában van. Előnyös, ha a találmány szerint stabilizálandó fiziológiailag aktív vegyület oldata állandóan 5 és 10 közötti pH értéken van, továbbá előnyös, ha a stabilizálandó oldathoz szolgáló oldószer egy megfelelő puffer. Megfelelő pufferként meg lehet említeni a foszfát-puffer és a trisz(hidroxi-metil)-aminometán-HCl puffert. Szükség szerint valamilyen sót, pl. nátrium-kloridot és kálium-kloridot adunk az oldathoz. így pl. valamilyen sót adunk az oldathoz, hogy izotóniás oldatot állítsunk elő, amikor oldatot alkalmazunk injekcióhoz. Valamely só adásának célja nem korlátozódik a fentiekre. Az ilyen sókoncentrációt az oldatban a só adásának céljától függően lehet meghatározni. így pl. amikor a végleges TNF oldatot alkalmazzuk injekcióhoz, izotóniás oldatot készítünk az oldatból nátrium-klorid hozzáadásával 0,15 mól/liter koncentrációjú. A jelen találmány módszere szerint hatásos mennyiségű albumint adunk a fiziológiailag aktív vegyületet tartalmazó vizes oldathoz vagy porhoz. Megfelelő albuminként megemlíthetjük a humán albumint és a szarvasmarha (bovin) albumint. Meg lehet említeni más állatoktól származó albuminokat is, mint pl. ló-, birka-, kecske- és csirke-albuminokat. A megfelelő albuminokra pontosabb példaként megemlíthetük a bovin szérum albumint, humán szérum albumint, bovin laktalbumint, humán laktalbumint és a humán placentából származó albumint. Az aktív vegyület stabilizálására irányuló képesség tekintetében nem figyelhető meg jelentős különbség a fentebb említett albuminok között. Az injekciós készítményekhez szolgáló stabilizálószerként azonban a humán szérum albumin a legelőnyösebb. A fentebb említett albuminokat használat előtt a szokásos módszerek szerint meg lehet tisztítani. 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
