200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B A jelen találmányban alkalmazandó albumint az oldathoz olyan mennyiségben adjuk, hogy 0,01- 10,0 mg, előnyösen 0,1 mg-1,0 mg legyen 1 ml olyan oldatban, amely 10-IO9 egység/ml (az aktivitás egységét később definiáljuk) citotoxikus aktivitással rendelkezik L-M sejtek ellen. Az albumint mennyiségének felső határát általában a következő szempontok szerint határozzuk meg: az albumin oldhatósága, a keletkező oldat viszkozitása és gazdaságossági szempontok. Az albumint mennyiségének felső határa általában 50 mg, előnyösen 10 mg 1 ml TNF-oldatra számítva. Amikor a stabilizálandó vegyület por formájában van, az albumint a porhoz olyan mennyiségben adjuk, hogy amikor ebből vizes oldatot készítünk olyan módon, hogy a por-formájú fiziológiailag aktív vegyületet feloldjuk, a 102-109 egység/ml aktivitást mutató oldatban a fentebb említett albumin-koncentrációk alakuljanak ki. A mód, ahogyan az albumint hozzáadjuk a vegyülethez, nem lényeges. így pl. por formájú albumint lehet közvetlenül hozzáadni az aktív vegyület oldatához. Egy másik módszer szerint az albumint porát fel lehet oldani, előnyösen vízben vagy alkalmas pufferben, és hozzáadni az oldathoz. Egy ismét másik módszer szerint az albumin porát össze lehet keverni az aktív vegyület porával. Az albumin hozzáadását bármikor végre lehet hajtani a tisztítási lépés során vagy a gyógyászati készítmény készítése során. Előnyös, ha a tárolást tisztítást és a fiziológiailag aktív vegyület oldatából albumint tartalmazó gyógyászati készítmény előállítását oldat formájában végezzük, 0° és 30 °C közti hőmérsékleten, előnyösen 0° és 10 °C közti hőmérsékleten. Amikor az oldatot fagyasztott formában tároljuk, előnyös, ha a tárolásra szolgáló hőmérsékletet 0 °C alatt, előnyösen -20 °C alatt tartjuk. Az oldat, amelybe a jelen találmány szerint megfelelő mennyiségű albumin van beépítve, megtartja aktivitását a tárolás során, akár cseppfolyós, akár fagyasztott formában, akár a tisztítási lépések során, akár a gyógyászati készítmények előállítása során. Ezentúl a fiziológiailag aktív vegyület stabilizálásának jelen találmány szerinti módszere alkalmas a liofilezéshez is. Megállapították, hogy amikor fiziológiailag aktív vegyület (főleg a nagy mértékben tisztított aktív vegyület esetében) oldatát liofilezésnek vetették alá, ennek aktivitásai általában jelentősen lecsökkentek. Hatásos mennyiségű albumint is tartalmazó jelen találmány szerinti oldatok azonban liofilezhetők aktivitásuk elvesztése nélkül, fiziológiailag aktív vegyület porát nyújtva. A port fel lehet oldani, olyan stabil vizes oldatot nyerve, amelyben az albumin és az aktív vegyület koncentrációi a fentebb meghatározott tartományba esnek. Az albumint egy másik módszer szerint be lehet építeni a fiziológiailag aktív vegyület liofilezett készítményeibe is. Amikor a fiziológiailag aktív vegyületet por formájában tároljuk, előnyös, ha a tárolásra szolgáló hőmérsékletet szobahőmérsékleten vagy annál alacsonyabban tartjuk. Az alább leírandó in vivo meghatározásokban, . amelyekben olyan leírandó in vivo meghatározá9 sokban, amelyekben olyan egereket használtunk, amelyekbe Meth A szarkómát ültettünk, és amelyekbe 300 egység, a jelen találmány szerint stabilizált tisztított, fiziológiailag aktív vegyületet adunk be, az aktivitást (+) jellel értékeljük. A rák jelentős növekedési gátlását vagy visszafejlődését figyeljük meg a tisztított, fiziológiailag aktív vegyület beadása után, a fiziológiás konyhasó-oldattal injektált kontroll egerekkel összehasonlítva, olyan egerekben is, amelyekbe Colon 26 végbél-karcinómát ültettünk be. Ezen kívül a tisztított fiziológiailag aktív vegyület különböző ráksejtek elleni citotoxikus aktivitását is értékeljük lényegileg azonos módon, mint a később említendőin vitro mérési módszerekben, azzal a különbséggel, hogy L-M sejtek helyett KB sejteket (adenokarcinóma), PC-8 sejteket (tüdőrák) és normál sejteket (humán embrió vese sejtek és humán embrió fityma sejtek), mint kontrollokat alkalmazunk, és 37 *C hőmérsékleten végzett 48 órás inkubálás helyett 37 ®C hőmérsékleten végzett 72 órás inkubálást alkalmazunk. A vizsgálat azt eredményezi, hogy a tisztított fiziológiailag aktív vegyület jelentős citotoxikus aktivitást mutat a ráksejtek ellen, míg nem mutat citotoxikus aktivitást a normál sejtek ellen. Hogy megvizsgáljuk a TNF aktivitást, általában két módszert alkalmazunk, azaz az in vivo, és az in vitro módszert, amelyben a neoplasztikus sejtek citotoxikus hatását mérjük in vitro. (1) In vivo mérési módszer In vivo módszerként meg lehet említeni pl. Carswell és munkatársai módszerét [lásd: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72, (9), 3666-3670 (1975)]..E szerint a módszer szerint Meth A sejteket (2.105 sejt) transzplantálunk intradermálisan (bőr alá) mindegyik B ALB/c egér hónaljába, és 7 nap múlva olyan egereket választunk ki értékelésre, amelyek 7-8 mm átmérőjű, véredényekkel jól ellátott, és spontán központi nakrózis nélküli tumorokkal rendelkeznek. 0,5 m, fiziológiás sóoldattal hígított mintát injektálunk be minden egyes egér farok-vénájába. A minta aktivitását 24 óra múlva értékeljük a következő kritériumok szerint: (-): nincs változás (+): gyenge hemorrhagiás nekrózis (+ +): mérsékelt hemorrhagiás nekrózis (a központi nekrózis a tumor felületének mintegy 50%ára terjed ki) (+ + +): jellegzetes hemorrhagiás nekrózis (masszív nekrózis, csak kis látható karimát hagyva a tumor határvonala mentén) (2) In vitro mérési módszer. Az aktivitás mérésére szolgáló in vitro módszerként meg lehet említeni pl. Ruff és munkatársainak módszerét [lásd: Lymphokines, 2. kötet, Kiadó: E. Pck, Academic Press, New York, 245-248 (1980)], valamint Kuli és munkatársai módszerét [lásd: J. Immunoi. 126 (4), 1279-1283 (1981)]. Az in vitro módszert, amelyet a jelen találmányban alkalmaztunk az aktivitás mérésére, a fentebb említett hagyományos módszerek javításával fejlesztettük ki. A jelen találmány feltalálóinak in vitro módszerét, amellyel a TNF citotoxicitását mérjük L-M sejtek [American Type Culture Collection (Amerikai Típustörzsgyűjtemény) CCL 1.2] ellen, 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
