200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B sainak „bemetszés (nick) transzlációs módszere szerint [lásd J. Mól. Bioi. 113,237 (1977)]. 3. ) Minden A/nyúl genom könyvtár bakteriofágot és X/humán genom könyvtár bakteriofágot lényegében összefolyással baktériumok mezőiére tekintünk el és átvizsgáljuk hibridizálásra a 32P-vel jelzett nyúl TNF cDNS-el. 4. ) Az alkalmazás kiónokkal a megfelelő DNS-t izoláljuk, restrikciós térképét elkészítjük és elemezzük Southem-hibridizálással [lásd E.M. Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)]. A nyúl vagy humán TNF géneket tartalmazó restrikciós fragmenseket plazmid vektorokba szubklónozzuk, majd szekvencia-analízisnek vetjük alá. 5. ) A nyúl TNF cDNS bázisszekvenciáját összehasonlítjuk a nyúl TNF gén bázisszekveniájával, hogy meghatározzuk az exonokat (bizonyos bázisszekvenciák, amelyek a nyúl TNF aminosavszekvenciáját kódolják) ésintronokat (bizonyos bázisszekvenciák, amelyek nem kódolják a nyúl TNF aminosav-szekvenciáját) a nyúl TNF génben. 6. ) Ezután a humán TNF gén bázisszekvenciáját összehasonlítjuk a nyúl TNF gén bázisszekvenciájával, hogy meghatározzuk a humán TNF gén exonjait és intronjait. 7. ) A nyúl TNF aminosav-szekvenciáját, amelyet a nyúl TNF gén intronjainak kihúzásával és a nyúl TNF exonjainak kombinálásával nyert bázisszekvenciából következtettünk ki, bizonyítjuk be, egyezésben azzal az aminosav-szekvenciával, amelyet a nyúl TNF cDNS bázisszekvenciájából következtettünk. 8. ) Ezután a jelen találmányban alkalmazandó fiziológiailag aktív vegyület aminosav-szekvenciáját következtetjük ki a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS bázisszekvenciájából, amelyet úgy nyerünk, hogy a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló gén intronjait kihúzzuk és az említett gén exonjait kombináljuk. 9. ) Ezután a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS-t felszabjuk in vitro egy megfelelő kifejeződő közvetítőbe való beiktatáshoz, hogy a kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-t képezzük. A rekombináns DNS-t használjuk egy alkalmas gazdasejt transzformálására, amelynek viszont lehetősége van a növekedésre tenyészetben, valamint a kívánt fizikailag aktív vegyület kifejezésére. 10. ) Az így előállított fiziológiailag aktív vegyület 155 aminosav-gyökkel rendelkezik érett formájában, szerinnel kezdve. Amikor ennek van jelző (szignál) peptidje az elő-szekvenciában, ez nagyon hidrofób jellegű. Az előzőekben ismertettük a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló gén nyerésének folyamatait, a fiziológiailag aktív vegyület kódoló DNS bázisszekvenciáját és a fiziológiailag aktív vegyület előállításának folyamatát a DNS alkalmazásával. Meg lehet érteni azonban, hogy az előbbiekben adott ismertetésnek nem az a célja, hogy korlátozza a módszert, és hogy azok, akik a szakterületen jártasak, nyilvánvalóan tudhatnak változtatásokat végezni. Az egyes aminosavaknak megfelelő kodon (genetikai kód) változtatható alkalmi gyakorisága következtében és más okokból a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS bázisszekvenciájának egy 5 részét vagy egészét helyettesíteni lehet szerves kémiai módszerekkel szintetizált mesterséges DNS- sel, anélkül, hogy ez az ebből nyert polipeptid aminosav-szekvenciájában változást okozna. Valószínű, hogy a fiziológiailag aktív vegyületet intracellulárisan éretlen formában lehet előállítani, mint prepeptidet vagy prepropeptidet, amelyeket fel lehet dolgozni egy intermedieren keresztül egy érett fiziológiailag aktív vegyületté a feldolgozás stádiumában. A fiziológiailag aktív vegyület éretlen formáját a humán TNF gén bázisszekvenciájából lehet kikövetkeztetni. A DNS-t, amely az éretlen vagy intermedier formájában levő fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS-t tartalmazza, szintén lehet rekombinálni természetes vagy mesterségesen szintetizált DNS-sel. Ennek a technikának egyik alkalmazását meg lehet valósítani olyan módon, hogy a metionin kodont (ATG) beiktatjuk az 5’ végbe és beiktatunk legalább egy stop kodont, amelyet TAA, TAG és TGA kodonok közül válogatunk ki, az érett vagy intermedier vagy éretlen TNF DNS 3’ végébe. A metionin kodon jelenlétének következtében az érett, vagy intermedier vagy éretlen fiziológiailag aktív vegyületet elő lehet állítani olyan mRNS-en, amelyet egy megfelelő promotor segítségével szintetizáltak. A fiziológiailag aktív vegyület N-terminálisához kötött metionin-gyököt azonban lehasítjuk vagy nem hasítjuk le az alkalmazott gazdasejt milyensége szerint. A stop kodon beiktatásának célja, hogy megállapítsuk a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS-ből átírt mRNS transzlációját a megfelelő helyzetnél (az I képletű polipeptid C- terminálisa). Ennek a technikának egy másik alkalmazását úgy lehet megvalósítani, hogy a DNS-hez egy nagyon hidrofób, „szignál szekvenciaként ismert bázisszekvenciát adunk. Ennek hozzáadásával keresztülvihető a fiziológiailag aktív vegyület kiválasztása a gazdasejten kívülre, vagy gram-negatív baktériumok esetében a periplazmaként ismert térbe. Amikor egy olyan vektort alkalmazunk, amelybe start kodont építettünk be, fúziós pepiidet lehet előállítani, amely tartalmazza a fiziológiailag aktív vegyületet és egy, a vektornak tulajdonítható pepiidet. Ebben az esetben a fúziós peptidet kémiai vagy enzimes úton el lehet hasítani. Egy másik módszer szerint a fúziós peptidet, ha a fiziológiailag aktív vegyület fő aktivitására nincs káros hatása, fel lehet használni úgy, ahogy van. A fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS-t hozzá lehet kapcsolni, az 5’ vég felé eső (fölfelé levő) területénél, egy promotor gén szekvenciához, ezáltal egy olyan TNF-DNS-promotor szekvenciát nyerve, amely nem gátolja a replikációját és nem okozza a károsan befolyásoltan keletkezett RNS transzlációját. Az így nyert tnf DNS-promotor szekvenciát lehet kombinálni olyan vektorral, amely replikálódni képes egy baktériumban vagy magasabbrendű organizmusok sejtjeire, így nyerhetünk rekombináns DNS-t. Az így nyert rekombináns DNS-t fel lehet használni egy gazdasejtként használt baktérium vagy magasabbrendű szervezet sejtje transzformálására. Az így nyert transzformánst lehet tenyészteni a fiziológiailag aktív vegyü-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
