200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B 39 40 aktív vegyület oldatát állítjuk elő, amelynek citotoxikus aktivitása 120 egység/ml. Az így nyert oldat alikvotjaihoz külön-külön HSA-t (humán szérum albumin) és BSA-t (bovin szérum albumin) adunk, így olyan minta-oldatokat 5 alakítunk ki, amelynek albumin-koncentrációit az 5. Táblázatban jelezzük. Az így létrejött minta-oldatok mindegyikénél meghatározzuk a megmaradó aktivitást a mintákat úgy vizsgálva, hogy egymás után tárolásnak vetjük alá 2 napig, 7 napig és 30 10 napig 4 °C hőmérsékleten. A fenti vizsgálat kivitelezésében azt az aktív vegyület-oldatot, amelybe albumin nincs beépítve, alkalmazzuk kontrollként. Hogy meghatározzuk a megmaradó aktivitást, az egyes minták aktivitását in vitro és in vivo meghatá- 15 rozzuk a korábban leírt módszerek szerint. Az in vitro módszerben a megmaradó aktivitást a következő egyenlet szerint számítjuk ki a vizsgálati értémegmaradó aktivitás (%) = - x 100 B (ahol A a minta citotoxikus aktivitása a tárolás vagy fizikai kezelés után és B a minta citotoxikus aktivitása a tárolás vagy fizikai kezelés előtt) Az in vivo módszerben mindegyik mintaoldatot koncentráljuk olyan módon, hogy a koncentráció húszszorosa legyen a kiindulási oldat koncentrációjának, a koncentrálást Mini-Module NM-3-al végezzük (az ultraszűrő berendezés védjegye, amelyet az Asahi Chemical Industry Co. Ltd., Japán, 25 30 gyárt és a Funakoshi Yakuhin, Japán, forgalmaz). Ezután az így koncentrált TNF oldatokból 0,5 ml-t injekciózunk a farok-vénán keresztül öt, tumorral rendelkező egérből álló csoport minden tagjába. A tumorellenes aktivitást 24 órával később vizsgáljuk meg a korábban leírt kritériumokkal összhangban. A nyert eredményeket az 5. Táblázatban és a 8. ábrán mutatjuk be. 2. példa Lényegében ugyanazt a módszert ismételjük meg, amelyet az 1. példában leírtunk, hogy az 1. példa szerinti mintaoldatokat elkészítsük. A megmaradó aktivitást minden egyes oldatnál meghatározzuk, a mintákat a következő műveleteknek vetve alá: i.) a mintákat egymás után fagyasztásnak (-70 °C) és felengedtetésnek vetjük alá, egy ciklust illetve három ciklust hajtva végre, és ii.) a mintákat fagyasztásnak (-70 °C), liofilezésnek és 7 napon át szobahőmérsékleten tárolásnak vetjük alá. A fenti vizsgálat kivitelezésében az albumint nem tartalmazó aktív vegyület oldatot használjuk kontrollként. A liofilezett termékkel (lásd ii.)) kapcsolatban ezt steril vízben oldjuk fel és így vetjük alá a citotoxikus aktivitás mérésének. Az egyes minták megmaradó aktivitását in vivő vagy in vitro mérjük az 1. példa szerint. Az eredményeket az 5. Táblázatban mutatjuk be. Összehasonlító példa Az 1. példában alkalmazott mintákkal azonos citotoxikus aktivitással bíró humán TNF oldat alikvotjaihoz egyenként különböző aminosavakat, fém-5. Táblázat (1. rész) 1. példa Körűimé- Tárolá 4 ®C hőmérsék- Tárolás 4 °C hőmérséknyek létén (oldat) létén (oldat) Aktivitásmérési módszer in vitro in vivo Stabilizáló szer Koncentráció mg/ml 0 napok 2 7 30 napok 0 7 semmi (kontroll) 100 45 14 2 + + +3, + +2 + 2,-3 HSA 0,1 100 99 95 91 ugyanaz + + +3, + +2 HSA 1 100 98 96 90 ugyanaz + + +3, + +2 BSA 1 100 97 98 94 ugyanaz + + +4, + +1 sókat és kelát-képző szereket, amelyekről jól ismert, hogy stabilizálószerei közönséges fiziológiailag aktív vegyieteknek, adunk külön-külön változó koncentrációban, amint ezt a 6. Táblázat bemutatja. Az így létrejött oldatok mindegyikét 4 °C hőmérsékleten tároljuk 7 napon át, és tumorellenes akti-21
