200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására

HU 200939 B

fiziológiailag aktív vegyülethez szolgáló gént tartalmazó egyik plazmid részletének restrikciós térképét mutatja be.

Az 5. ábra a hagyományos nyúl TNF-hez szolgáló gént tartalmazó egyik plazmid részletének restrikciós térképét mutatja be.

A 6. ábra a jelen találmányban alkalmazandó fiziológiailag aktív vegyületet kódoló rekombináns DNS (pHTNF- lacUV5-1) előállítására szolgáló eljárás folyamatábráját mutatja be.

A 7. ábra a jelen találmányban alkalmazandó fiziológiailag aktív vegyületet kódoló másik rekombináns NDS (pHTNF-llacUV5-2) előállítására szolgáló eljárás folyamatábráját mutatja be.

A & ábra grafikont mutat be, amely humán szérum albumin koncentrációjának hatását ábrázolja az alkalmazandó fiziológiailag aktív vegyület megmaradó aktivitására 4 °C hőmérsékleten 7 napon történt tárolás után.

A jelen találmány továbbá eljárást ismertet fiziológiailag aktív anyag stabilizálására, amely egy fiziológiailag aktív vegyületet tartalmazó vizes oldathoz hatásos mennyiségű albumin hozzáadásából áll, ahol az említett fiziológiailag aktív vegyület olyan, amelyet a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-t alkalmazó rekombináns DNS technikával állítottak elő, és amelynek citotoxikus aktivitása van L-M sejtek ellen és képes indukálni az átültetett Meth A szarkóma hemorrhagiás nekrózisát NALB/c egerekben.

Amint korábban említettük, a jelen találmányban alkalmazandó fiziológiailag aktív vegyület olyan vegyület, amelyet a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-t alkalmazó szokásos rekombináns technikával állítottak elő. Amikor a fiziológiailag aktív vegyületet a később leírt módszer szerinti vizsgálatnak vetjük alá, a fiziológiailag aktív vegyület citotoxikus aktivitást mutat L-M sejtek ellen és az átültetett Meth A szarkóma hemorrhagiás nekrózisát indukálja BALB/c egerekben. Részletezve, a fiziológiailag aktív vegyület polipeptid, amelynek aminosav-szekvendáját az (I) képlet mutatja be:

Ser Ser Arg The Ser Asp Lys Val Alá His Val Val Ala Asn Pro Ghi Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Lez Thr His The Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala lie Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

ahol Gin jelentése glutamin-gyök, Asp aszparaginsav-gyök, Pro Prolin-gyök, Tyr tirozin-gyök, Val valin-gyök, Lys lizin-gyök, Glu glutaminsav-gyök, Ala alanin gyök, Asn aszparagin-gyök, Leu leucingyök, Phe fenilalanin-gyök, Gly glicin-gyök, His hisztidin-gyök, Ser szerin-gyök, Thr treonin-gyök, Ile izoleucin-gyök, Trp triptofán-gyök, Arg arginingyök, Met metionin-gyök és Cys cisztein-gyök, me-3

lyek L-aminosavakból származnak.

A fenti aminosav-szekvenciával rendelkező fiziológiailag aktív vegyületet a szokásos rekombináns DNS technikával lehet előállítani, olyan rekombináns DNS-t alkalmazva, amely tartalmazza a fiziológiailag aktív vegyületet kódoló DNS-t és amelyet jellemez, hogy tartalmazza a (II) képlettel jellemzett bázisszekvenciát, vagy ennek az említett bázisszekvenciának komplementor bázisszckveniáját. A (II) képlet:

TCA TCT TCT CGA ACC AGT GAC AAG CCZ GRA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GTC GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CZC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTCCTCTTC AAG GGC CAA GGCTGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGX ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT6 GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC ITC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GTC GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG,

ahol A jelentése dezoxidenilsav-gyök, g dezoxiguanilsav-gyök, C deozbdcitidilsav-gyök és T timidilsav-gyök, és ahol a (II) képlet bal vége képviseli az 5’ hidroxil-csoport oldat és a jobb vége a 3’-hidroxil-csoport oladalt.

A fent említett fiziológiailag aktív vegyületet és a fent említett DNS-t a következő módon nyerhetjük.

1. ) A T. Maniatis professzor által előállított [Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University (Harvard Egyetem,. Biokémiai és Molekulárbiológiai Részleg), Divinity Avenue, Cambridge, Massachussets 02138, Amerikai Egyesült Államok] X(nyúl genom-könyvtár bakteriofágot és X.) humán genom-könyvtár bakteriofágot alkalmazzuk. Ezeket az anyagokat a kővetkező eljárás szerint készíthetjük (lásd: Cell, 15 687 /1978/):

(1) nyúl vagy humán szövetet, pl. nyúl vagy humán hasnyálmirigy-szövetet feldolgozunk fagyasztott porrá és kezeljük az RNS és fehéije anyagok elemésztése céljából, és kicsapásra így nagy molekulasúlyú nyúl vagy humán DNS-t nyerünk.

(2) a nagy molekulasúlyú DNS-t részlegesen emésztjük véletlenszerű hasításokkal a génhelyek (lókuszok) tekintetében;

(3) az így létrejött DNS fragmenseket méret szerint frakcionáljuk, 15-20 kilobázispár (kb) fragmenseket kapva;

(4) a (3) lépés szerint nyert fragmenseket X Charin 4A fág vektort alkalmazva klónozzuk; és

(5) az így létrejött vektorokat rDNS-t tartalmazó fertőző fág-részecskékbe foglaljuk be in vitro, hogy a fentebb említett nyúl vagy humán genom könyvtárat nyerjük.

2. ) Az 1. referenciapéldában nyert nyúl TNF cDNS-t 32P-vei jelezzük P.WJ. Rigby és munkatár4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3