200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B 37 °C, 2 óra 2. ) Etanolos kicsapás: kicsapás 3. ) Desztillált víz hozzáadása a csapadékhoz: 1 jxg/jxl, Eco RI-vel hasított pHGE-oldat készítése 4. ) Emésztés különböző restrikciós enzimekkel: lfig pHGE/Eco Rí Restrikciós enzimek: 5 egység Pvu II, 5 egység Pvu II + 10 egység Rsa 1,4 egység Mst II, 3 egység Ava 1,9 egység Pst I, 37 °C, 2 óra 5. ) Elektroforézis: 2% agaróz gél, 1 x TAE, 28 V, 14,5 óra 6. ) Átvitel nitrocellulóz szűrőre: [lásd E.M. Southern: J. Mól. Bioi. 98,503 (1975)] 7. ) Első elő-hibridizálás: 30 ml FDSS 42 °C, 6 óra 8) Első hibridizálás: pR 18 5’ fragmens (5.104 cpm/ml) (a 4. lépés szerint készítve) 42 °C, 14 óra 9. ) Mosás: 2 x SSC - 0,1% SDS, szobahőmérsékleten. Bemerítés négyszer, 10 percen át; 1 x SSC - 0,1% SDS, 50 °C hőmérsékleten. Bemerítés kétszer, 30 percen át 10. ) Expozíció: XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA) -80 °C, 2 erősítő szűrő, 17,5 óra 11. ) Kimosás 0,5 mól/liter NaOH -1,5 mól/liter NaCl (Bemerítés: 1 perc) 0,5 mól/liter Trisz -1,5 mól/liter NaCl (Bemerítés: 1 perc); 3 x SSC (Bemerítés: 1 perc) 12. ) Expozíció: Azonos módon végrehajtva, mint az előbb, a 10. pontnál, azzal a különbséggel, hogy az expozíciós idő 19 óra 13. ) Második elő-hibridizálás: Azonos módon, mint az előbb, a 7. pontnál) 14. ) Második hibridizálás: pB 2-7 beiktatás (pB 2-7 előállítva a 2. referencia-példa 3. lépése szerint), 42 °C, 16,5 óra 15. ) Expozíciós: Azonos módon végrehajtva, mint az előbb, a 10. pontnál, azzal a különbséggel, hogy az expozíciós idő 19,5 óra 17. ) Kimosás: Azonos módon, mint az előbb all. pontnál 18. ) Expozíció: Azonos módon végrehajtva, mint az előbb, a 10. pontnál, azzal a különbséggel, hogy az expozíciós idő 20 óra 19. ) Harmadik elő-hibridizálás: Azonos módon, mint az előbb, a 7. pontnál 20. ) Harmadik hibridizálás: pR 18 3’ fragmens (4,5.10s cpm/ml) (előállítva a 2. referencia-példa 4. lépése szerint) 42 °C, 15 óra 21. ) Mosás: Azonos módon, mint az előbb, a 9. pontnál 33 22.) Expozíció: Azonos módon végrehajtva, mint az előbb, a 10. pontnál. A restrikciós enzimes elemzés eredményeit a 4. ábra mutatja be. 12. lépés A pRGE plazmid DNS restrikciós enzimes elemzése Lényegében azonos módon, mint a fenti 11. lépésben hajtjuk végre a fenti 10. lépésben előállított pRGE plazmid DNS restrikciós enzimes elemzését, azzal a kivétellel, hogy a pRGE plazmid DNS-t alkalmazzuk a pHGE plazmid DNS helyett. A pRGE DNS beiktatott rész (inzert) így nyert restrikciós térképét az 5. ábrában mutatjuk be. 13. lépés A nyúl TNF gén és humán TNF gén bázisszekvenciájának meghatározása Lényegében ugyanazt a módszert ismételjük meg, amelyet a 2. lépésben alkalmaztunk, azzal a különbséggel, hogy a 9. lépésben nyert E. coli K12 JM 83 (pHGE) törzset és a 10. lépében nyert E. coli K 12 JM 83 (pRGE) törzset alkalmazzuk a pB 2-7-el rendelkező E. coli K 12 MC 1061 törzs és a pR 18-al rendelkező E. coli K 12 MC 1061 törzs helyett. így 150-150 p.g pRGE plazmid DNS-t és pHGE plazmid DNS-t nyerünk. A pRGE és pHGE bázisszekvenciáit a Maxam- Gilbert módszer szerint [Maxam és munkatársai: Methods in Enzimology, 55. kötet, 490 (1980), kiadó: Academic Press] határozzuk meg. Az 1. referencia-példában meghatározott bázisszekvenciát összehasonlítjuk a pRGE bázisszekvenciájával, amelyet a fentiekben határoztunk meg, hogy világossá tegyük a nyúl TNF gén szerkezetét, beleértve az exont és intront. A pRGE DNS beiktatott rész (inzert szerkezetét az 5. ábra mutatja be. Ezt követően a pRGE bázisszekvenciáját összehasonlítjuk a pHGE bázisszekvenciájával, hogy megvizsgáljuk a homológiát és a megegyező szekvenciákat az intron és exon határa körül. így a humán TNF gén szerkezetét, beleértve az exont és az intront, megvilágítjuk. A humán TNF gén szerkezetét a 4. ábra mutatja be. A nyúl TNF-et és humán TNF-et kódoló fentebb említett bázisszekvenciákat az alábbiakban mutatjuk be. A bázisszekvenciákban a felső sor mutatja a nyúl TNF-et (Ny) kódoló bázisszekvenciát és az alsó sor a humán TNF-et (H) kódoló bázisszekvenciát mutatja be. Ny TCA GCTTCT CGG GCC CTG AGT CAG AAG CCT CTA GCC CAC GTA GTA G TCA TCT TCT CG A ACC CCG AGT G AC AAG CCT GRA GCC CAT CTT GTA Ny GCA AAC CCG CAA CTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT H GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG Ny GCG AAC GCC CTG CTG CGC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG H GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA CAT AAC CAG Ny CTG GTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT H 34 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
