200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC Ny CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC ... TAC GTG CTC CTC ACT H CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC Ny CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC H CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC Ny CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG H CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG Ny GAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC H GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG Ny GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC H GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT Ny CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT H CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT Ny GGG ATC ATT GCC CTG H GGG ATC ATT GCC CTG Megyjegyzés A „... jel azt jelenti, hogy ez a darab a nyúl TNF-et kódoló DNS bázisszekvenciájában hiányzik és ezért az ezzel a jellel ennek két oldalán szomszédos két kodon közvetlenül össze van kapcsolva. 14. lépés Oligodezoxi-nukleotidok szintézise Egy 500 pj-es rozsdamentes acél reakcióedénybe, amely rozsdamentes acél szűrőkkel van ellátva mindkét végén, 20m g polisztirol gyantát adunk, amelybe egy nukleozid (2,0 p,mól/liter) van kapcsolva szukcinát kötésen át. A gyantát cink-bromiddal (1 mól/liter, diklór-metán-izopropanol (85:15)ben) kezeljük, hogy eltávolítsuk a dimetoxi-tritil (DMT) védőcsoportokat, dimetil-formamiddal mossuk, majd piridinnel és acetonitrillel, és nitrogén-áramban szárítjuk. A szárított gyantához DMT-nukleotid (20|i.mól/liter) és mezitilén-szulfonil-nitrotriazol (60 p.mól/liter) piridines oldatát (200 pj) adjuk. A kapcsolási reakciót hagyjuk végbemenni 45 °C hőmérsékleten 20 percen át. A védőcsoport-mentesítés és kapcsolás ciklusát ismételjük az egymást követő nukleotidokhoz, amíg a kívánt oligodezoxi-nukleotidot összeillesztjük a gyantán. A gyantát azután kezeljük, hogy az oligodezoxi-nukleotidot eltávolítsuk róla, és a terméket tisztítjuk, amint ezt Ito, Ike, Ikuta és Itakura leírták Nuc. Ac. Res. 10,1755 (1982). így a következő oligodezoxi-nukleotidokat nyerjük 1. ) 5’-AATTCATGTACTCTTCTCGAACCCCGAGTGACAA-3’ 2. ) 3’-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTTCACTGTTCGG-5’ 3. ) 5’-GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC-3’ 4. ) 3’-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGAGT-5’ 35 15. lépés A TNF-hez szolgáló humán minigént tartalmazz M13mp9-HGE megalkotása 10 p.g pHGE plazmidot emésztünk eco RI-vel (20 egység). Elektroforézis után 1%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen, a 2,9 kb-s fragmenst eluáljuk. Ezt a fragmenst Eco Rí fragmensbe iktatjuk be az M13 mp 9 fág replikálódó formájából. Az M13 mp 9 fágot azért választjuk, mert ez különösen illik a DNS-szekciók befogadásához. A terméket átfertőzzük E. coli JM103-ba [BRL (Bethesda Research Laboratories, Inc., USA), User Manual (M13 mp 7 Cloning/’Dideoxy’ sequencing, (1980)] A terméket M13 mp 9-HGE-vel jelöljük. 16. lépés A 3. intron kiiktatása, ml3 mp 9-HGE egyszálú DNS-t és E 3-4 kiiktatót (deletert) alkalmazva AzM13 mp 9-HGE egyszálú DNS-t a BLR User Manual (M13 mp 7 cloning) ’Dideoxy* sequencing, 1980, módszere szerint állítjuk elő. A 4. oligonukleotidot, 3’-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGG AGTTCG ACT-5’, amelyet a 14. lépésben állítunk elő, alkalmazunk kiiktatónak (deléter) a 3. intronhoz. A 3. intronhoz szolgáló delétert „E 3-4-el jelöljük. Az E3-4 kiiktató (deléter) olyan bázisszekvenci ával bír, amely komplementer a 3. intron előtti (3 exon) és utáni (4. exon) bázisok bázisszekvenciájával, amelyek kiiktatandók. A 3. nitron kiiktatását Wallace és munkatársai kitanításával [Science, 209, 13% (1980)] összhangban hajtjuk végre a következőképpen. E3-4-et (164 ng, 15 pmól) foszforilezünk T4 kinázt (10 egység) és ATP-t (3 mmól/liter) alkalmazva és hozzáadjuk az M13 mp 9-HGE templáthoz (1,65 p.g, 0,5 pmól). A reakciókeveréket melegítjük 65 °C hőmérsékleten 10 percen át, lehűtjük szobahőmérsékletre 5 perc alatt, végül jeges vízben hűtjük. dATP-hez, dCTP-hez, dGTP-hez, dTTP-hez és ATP-hez (0,4 mmól) Klenow-fragmenst (5 egység), és T4 ligázt (10 egység) adunk Hin pufferben [Wallace és munkatársai: Nuc. Ac. Res. 9, 3647 (1981)], amely 10 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH 7,2), 2 mmól/liter MgCte-t és 1 mmól/liter ß-merkaptoetanolt tartalmaz. A reakciókeveréket (végső térfogat 501) inkubálunk 30 percen át 4 °C hőmérsékleten, majd 30 percen át szobahőmérsékleten. Az oligonukleotiddal mintázott reakcióból származó DNS-t használjuk az E. coli JM103 transzfektálására a BLR User Manual/M13 mp 7 cloning/’Didezoxy* sequencing, 1980, eljárásával összhangban Az ezen az úton nyert tarfoltokat YT lemezekre szürküljük át [J.H. Miller: Experiments in Molecular Genetixs, 433. oldal, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)]. A nyert telepeket hibridizáljuk 55 °C hőmérsékleten 2 órán át 32P jelzett E3-4-el. Ehhez a lépéshez a delétert használjuk a vizsgáló mintaként, hogy azonosítsuk a megfelelő komplementer bázisszek venciával rendelkező DNS szekvenciáját, miután az intront kiiktattuk. A fágokat azokból a telepekből izoláljuk, amelyek hibridizálnak a deléterrel. A létrejött fágokat lemezre szélesztjük és tarfol-36 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
