200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B követi a kicsapás ammónium-acetátot tartalmazó etanollal. így 637 ng (kitermelés: kb. 30%) HG- 3/Eco Rí 2,9 kb fragmenst nyerünk. 2S5 ng fentebb nyert fragmenst ligálunk 56,5 ng Eco RI-vel hasított pUC 13-hoz [J. Messing: Methods in Enzimology, 101. kötet, 20 (1983)], 2,5 egység T4 ligázt alkalmazva 4 °C hőmérsékleten 20 órán át. E. coli K 12 JM 83 törzset transzformálunk a fentebb említett ligálási terméket alkalmazva. Részletesebben, E. coli K12 JM 83 törzset tenyésztünk LB tápközegben, amíg a tenyésztő tápleves optikai sűrűsége eléri a 0,3 egységet 550 nm-nél. 50 ml kinőtt E. coli K 12 JM 83 törzs tenyészetet összegyűjtünk, 25 ml, 10 mmól/liter MOPS-t (pH 7,0), 10 mmól/liter RbCl-t tartalmazó oldattal mossuk, és újból szuszpendáljuk 25 ml, 0,1 mól/liter MOPS-t (pH 6,5) - 50 mmól/liter CaCk-t - 10 mmól/liter RbCl-t tartalmazó oldatban. A szuszpenziót jégen hűtjük 30 percen át, centrifugáljuk és újra szuszpendáljuk 2 ml, 0,1 mól/liter MOPS-t (pH 6,5) - 50 mmól/liter CaCl-t -10 mmól/liter RbCl-t tartalmazó oldatban és 30 pj DMSO-ban. 203 pl szuszpenzióhoz 10 pl vizes ligációs termék oldatot adunk, amely 10 ng ligációs terméket tartalmaz. A keveréket jégen hűtjük 30 percen át, majd 42 °C hőmérsékleten melegítjük 60 másodpercig. Közvetlenül ezután 5 ml, 37 °C hőmérsékleten előmelegített LB tápközeget adunk a melegített keverékhez, ezt követi az inkubálás 37 °C hőmérsékleten 1 órán át. A nyert tenyésztő táplevest centrifugálásnak vetjük alá és a felülúszót eltávolítjuk. LB tápközeget adunk a keletkezett sejt-üledékhez, majd inokulálunk egy LB lemezre, amely 30 pl/ml amplicillint és 40 pg/ml X-gal-t is tartalmaz. Az olyan E. coli K 12 JM 83 törzset tartalmazó telepek, amelyek transzformálódtak a beiktatott résszel (inzerttel) rendelkező plazmidokkal, fehérek, míg azok, amelyek olyan E. coli K 12 JM 83 törzset tartalmaznak, amelyek csupán a plazmiddal transzformálódtak, kékek. A nyert fehér telepeket ismét inokluljuk LB lemezeken, amelyek 30 pg/ml amplicillint és 40 pg/ml X-gal-t tartalmaznak, bizonyítás céljából. A fentebb nyert fehér telepek közül tíz telepet (bakteriális kiónok) kiválasztunk és átvizsgáljuk Holms és Quigley „mini-prep technikáját alkalmazva [Anal. Biochem., 114. kötet, 193 (1981)]. Részletesebben, minden telepet egy éjszakán át tenyésztünk LB tápközegen, amely 30 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A kinőtt sejteket összegyűjtjük, és 2 mg/ml lizozimot, 50 mmól) liter glükózt, 10 mmól/liter EDTA-t és 25 mmól/liter Trisz HCl-t (pH 8,0) tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót állni hagyjuk szobahőmérsékleten 5 percen át, majd hpzzá adunk 200 pl,0,2 n NaOH-t és 1% SDS-t tartalmazó oldatot. Lassú keverés után a szuszpenziót állni hagyjuk szobahőmérsékleten 2 percen át. Ezután 150 pl3 mól/literes nátrium-acetát oldatot (pH 5,2) adunk hozzá, állni hagyjuk -20 °C hőmérsékleten 10 percen át, majd 15 percen át centrifugálunk, így nyerjük ki a keletkezett felólúszót. A felülúszóhoz 900 pl hideg etanolt adunk, majd 5 percen át centrifugáljuk, hogy kinyerjük a keletkezett csapadékot. A kinyert csapa31 dékot 70%-os etanollal mossuk és szárítjuk, a plazmid DNS-t nyerve. A fentemlített módszerrel tíz plazmid DNS-t nyerünk. Mindegyik plazmid DNS-t feloldjuk 10 mmól/liter Trisz- 0,1 mmól EDTA (pH 8) oldatban, emésztjük Eco RI-vel és elektroforézisnek vetjük alá restrikciós elemzés céljából. Az emésztés és az elektroforézis körülményei a következők: Emésztés: plazmid DNS oldat, a fentebb készített mennyiség egy ötödé; Eco RÍ, 3 egység; 37 °C hőmérséklet; 1,5 óra. Elektroforézis: 1%-os agaróz gél; 1 x TAE; 120 V; 2 óra. A fenti restrikciós elemzés azt mutatja, hogy a tíz klón közül nyolc pozitív, vagyis a nyolc klón rendelkezik a 2,9 kb-s fragmenssel. A nyolc pozitív kiónból egy kiónt választunk ki és elnevezzük E. coli K 12 JM 83 (pHGE) törzsnek (ATCC 39656). Lényegében azt az eljárást, amelyet a 2. lépésben ismertettünk, ismételjük meg, így 1,89 mg pHGE DNS-t nyerünk, az eljárásban csak az a különbség, hogy E. coli K 12 JM 83 (pHGE) törzset alkalmazunk a pB 2-7-et és pR 18-at befogadó E. coli helyett. 10. lépés Az Eco RI-val hasított RG-1 szubklónozása 30 pg RG-l-et, amelyet a 6. lépés szerint állítunk elő, emésztünk Eco RI-vel. Az így létrejött fragmens-keverékből a mintegy 3,5 kb hosszúságú fragmenst lényegében azonos módon nyeljük ki, mint a 9. lépésben, azzal a kivétellel, hogy az előbb említett fragmens-keveréket és 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélt alkalmazunk. 1,0 pg Eco RI-vel hasított RG-1 fragmenst (mintegy 3,5 kb) nyerünk. Az így nyert, Eco RI-vel hasított RG-1 fragmenst (3,5 kb) ligáljuk az Eco RI-vel emésztett pUC 13- hoz lényegében azonos módon, mint a 9. lépésben, azzal a kivétellel, hogy az előbb említett Eco RI-vel hasított fragmenst (3,5 kb) alkalmazzuk az Eco RI-vel hasított HG-3 fragmens (2,9 kb) helyett. Az E.coli K 12 JM törzs transzformálását, a baktérium-klónok átvizsgálását, a kiónok emésztését és az elektroforézist lényegében azonos módon hajtjuk végre, mint a 9. lépésben, azzal a kivétellel, hogy az előbb említett ligálási terméket alkalmazzuk. A nyert E. coli K12 JM 83 (pRGE)-vel jelöljük (ATCC 39655). Lényegében a 2. lépésben leírt módszert ismételjük meg, hogy 1,70 mg pRGE DNS-t nyerjünk, azzal a kivétellel, hogy E. coli K12 JM 83 (pRGE) törzset alkalmazunk pR 2-7 és pR 18 helyett. 11. lépés A pHGE plazmid DNS restrikciós enzim analízise A 9. lépésben nyert pHGE DNS restrikciós enzimes elemzését Maniatis módszere szerint hajtjuk végre [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 98 (1982)].Az alkalmazott módszerek és körülmények a következők: 1.) A pHGE DNS emésztése Eco RI-vel: 18,6 pg pHGE DNS 64 egység Eco Rí 32 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
