200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B 10 egység Hind III, 10 egység PvuII, 37 °C, 3 óra 3. Elektroforézis: 0,8% agaróz gél TAE 28 V, 15,5 óra 4. Átvitel (transzfer) nitrocellulóz szűrőre: [lásd E.M. Southern, J. Mól. Bioi., 98, 503 (1975)] 5. Elő-hibridizálás: 30 ml FDSS 42 °C, 6 óra 6. Hibridizálás pR 18 5’ fragmense (a 2. referencia-példa 4. lépése szerint előállítva) 42 °C, 14 óra 7. Mosás 2xSCC - 0,1% SDS szobahőmérsékleten, 29 4-szer 10 percig bemerítés; 50 °C hőmérsékleten, lxSSC - 0,1% SDS, 2x30 percig bemerítés 8. Expozíció: 5 XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA) -80 °C, 2 erősítő szűrő, 14 óra A hibridizálás eredményeit a 4. táblázat mutatja be. 10 8. példa Nyúl kiónok Southern foltképző elemzése Lényegében a 3. referencia-példa 7. lépésében leírt folymatot ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy az RG-1 és RG-2 bakteriofágokat alkalmaz-15 zuk a HG-3, HG-6 és HG-7 bakteriofágok helyett, így hajtunk végre Southern foltképző elemzést. Ennek eredményeként úgy találjuk, hogy a pR 18 5’ fragmens 30 4. Táblázat Enzim Klón (bakteriofág) Hibridizáló fragmens mérete a mintával (pR 18) 5’ vég y vég BamUl HG-3 6,7 kb ) HG-6 11,2 kb ) HG-7 9,2 kb > Barn Hl HG-3 2,9 kb > + HG-6 2,9 kb ) Eco Rí HG-7 ) HG-3 ) Eco Rí HG-6 ) HG-7 ) HIN III HG-3 ) + HG-6 ) Eco Rí HG-7 > HG-3 9,7 kb ) Hindlll HG-6 4,1 kb > HG-7 9,7 kb > HG-3 2,2 kb 0,9 kb Pvu II HG-6 1,9 kb 0,9 kb HG-7 2,2 kb 0,9 kb Megjegyzés: A) jel azonos fragmens hibridizátumokat jelent hibridizálódik azoknak a fragmenseknek egyik egyedi csík fragmensével, amelyeket RG-1 és RG-2 Bam Hl-vel, Eco RI-vel, Bgl II-vel, Hind III-al és Bam Hl + Eco RI-vel végzett hasításával nyerünk. 9 9. lépés Humán genom TNF gént tartalmazó bakteriális kiónok megalkotása Landy és munkatársainak módszerét [Biochemistry, 13. kötet, 2134 (1974)] alkalmazzuk, hogy a HG-3 DNS-ét kinyerjük, amint ezt az előző 5. lépésben kinyertük. 33 ng így nyert HG-3 DNS-t emésztünk 80 egység Eco RI-vel 37 °C hőmérsékleten 3 órán át. Az emésztett anyagot elektroforézisnek vetjük alá 1%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen (feltételek: 1 x TAE, 20 V, 14,5 óra). A 2,9 kb-s csíkot izoláljuk az agaróz gélről olyan módon, ahogyan ezt Maniatis leírta [T. Maniatis: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 377. oldal (1982)]. Részletesebben, a 2,9 kb-s csík-rész kivágott géljét 65 °C hőmérsékleten melegítjük 15 percen át. Áz Eco RI-vel hasított HG-3 fragmenst, amely 2,9 kb hosszúsággal rendelkezik (ezután gyakran hivatkozunk erre, és „HG-3/Eco Rí 2,9 kb fragmens-nck jelöljük), kinyerjük az olvadt gélből 3-szor fenollal, majd 3-szor etanollal extrahálva, ezt 16
