200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B 5. lépés A humán genom TNF gén izolálása A 2. referencia-példa 3. lépésében nyert, 32P-vel jelzett pB 2-7 plazmid beiktatott részt (inzertet) alkalmazzuk hibridizáló mintaként, hogy átvizsgáljuk Charon 4 A/humán genom „könyvtár bakteriofág 106 tarfoltját. Ezt a bakteriofágot a részlegesen emésztett humán DNS-ből származó méret szerint osztályozott fragmenseknek [Maniatis és munkatársai: Cell 15,687 (1978)] beiktatásával nyeljük a Charon 4 A ÉcoRI ligációs helyére [Blattner és munkatársai: Science, 186,161 (1977)]. Benton és Davis tarfolt-hibridizációs módszerét alkalmazzuk [Benton és Daws: Science, 196,180 (1977)]. Mivel nem az összes bakteriofág tartalmazza a kiinduló tenyészetben a szükséges genetikai anyagot a humán TNF nyeréséhez, egy mintát alkalmazunk, amelynek bázisszekvenciája komplementer a nyúl TNF génhez. A fág-tarfoltoknak olyan DNS-ei, amelyek rendelkeznek a kívánt genetikai anyaggal, beépítik a radioaktív mintát és így radioaktivitásuk alapján azonosíthatók. Kilenc hibridizáló tarfoltot izolálunk a „könyvtár-ból. Az alkalmazott folyamatok és körülmények a következők: 1. ) A tarfoltok száma: ~ 1.106 tarfolt (~ 4.104 * tarfolt/150 mm átmérőjű lemez x 25). 2. ) Átvitel nitrocellulóz szűrőkre: [lásd Benton és Davis: Science, 196,186 (1977)] 3. ) Hibridizálás 1,25.10s cpm/ml pB 2-7 beiktatott rész (inzert) minta (az 1.) referencia-példa 3. lépése szerint előállítva) hozzáadása, 42 °C, 19,5 óra 4. ) Mosás 2xSSC -0,1% SDS, szobahőmérsékleten Bemerítés négyszer 10 percen át; 1 x SSC - 0,1% SDS, 50 °C hőmérsékleten. Bemerítés kétszer 30 percen át 5. ) Expozíció: XAR-5 (Eastman Kodak Company, USA) -80 °C, 2 erősítő szűrő, 39 óra A fenti átvizsgálásban 12 törzs-jelöltet nyerünk. Azonos módon, amint ezt fentebb említettük, egy második átvizsgálást hajtunk végre, így kilenc olyan törzset nyerünk, amely tartalmazza a szóban forgó fragmenseket. Ezeket a törzseket alkalmazva harmadik átvizsgálást hajtunk végre azonos módon, mint ahogy fentebb említettük, és kilenc törzset nyerünk, amely tartalmazza a szóban forgó fragmenst. Ezeket a törzseket alkalmazva negyedik átvizsgálást hajtunk végre, hogy bebizonyítsuk, hogy a kilenc törzs tartalmazza a szóban forgó fragmenst. A nyert kilenc bakteriofágot, amelyek tartlmazzák a szóban forgó fragmenst, HGl-től HG9-ig jelzéssel nevezzük meg. 6. lépés A nyúl genom TNF gén izolálása Lényegében a 2. referencia-példa 5. lépésében leírt folyamatot ismételjük meg azzal a kivétellel, hogy Charon 4 A) nyúl genom könyvtár bakteriofágot alkalmazunk [amelyet emésztett nyúl DNS-t alkalmazva készítünk emésztett humán DNS helyett, lásd: Maniatis és munkatársai: Cell, 15, 687 (1978)]. 27 Charon 4 A/nyúl genom könyvtár bakteriofág 6,7.10s tarfoltját alkalmazzuk a Charon 4 A/humá: genom könyvtár bakteriofág 106 tarfoltja helyett. Ilyen módon két bakteriofág törzset nyerünk (RG-1 és RG-2), amelyek tartalmazzák a nyúl genom TNF gént. 7. lépés A humán kiónok Southern foltképző elemzése A 2. referencia-példa 5. lépésében nyert HG-3, HG-6 és HG-7 bakteriofágokat alkalmazva az egyes bakteriofágok DNS-eit kinyerjük a következő folyamat szerint. 6.1010 E. Coli E 392 Tígazdasejt) szuszpendálunk 18 ml SM-ben és 3.HTPFU HG-3 bakteriofágot adunk hozzá, így lehetővé téve az E. coli fertőződését, 37 °C hőmérsékleten 20 percen át. Ezután a nyert keveréket 3 liter NZ-táplevesbe adjuk és rázatásnak vetjük alá rázótenyészetben 37 °C hőmérsékleten 23 órán át. 60 ml CHCb-at adunk a keverékhez és további 30 perces rázatásnak vetjük alá rázótenyészetben. NaCl-t adunk a tenyészethez, hogy 1 mól/liter legyen a végső koncentráció, a keveréket állni hagyjuk 15 percen át, majd centrifugáljuk, így egy felülúszót nyerve. Ezután polietilén-gíikolt (molekulasúly, kb. 6000) adunk a keverékhez úgy, hogy a polietilén-glikol koncentrációja 10% (súly/térf.) legyen, és állni hagyjuk 22 órán át 4 °C hőmérsékleten. A bakteriofágokat centrifugálással összegyűjtjük. A nyert bakteriofágokat 28 ml SM-ben szuszpendáljuk és azonos térfogat CHCI3- at adunk hozzá. Vortex-el történő 30 másodperces kevertetés után a keveréket centrifugálásnak vetjük alá, hogy vizes fázist nyerjünk. A vizes fázishoz SM-et adunk úgy, hogy a teljes térfogat 30 ml legyen. 24,6 g CsCl-t adunk az így nyert keverékhez és óvatosan feloldjuk, ezt követően ultracentrifugálást végzünk (45 000 ford./perc, 20 óra), hogy a bakteriofágokat egy csík formájában kinyerjük. A bakteriofágokat tartalmazó keveréket 10 mmól/liter NaCl - 50 mmól/liter Trisz (pH 8) -10 mmól/liter MgCb ellen dializáljuk. Ezután EDTA-t, K- proteinázt és SDS-t adunk a keverékbe, hogy ezek koncentrációja 20 mmól/liter, illetve 50 pg/ml, illetve 0,5% (súly/térf.) legyen. Ezután a keveréket 65 °C hőmérsékleten egy órán át kezeljük és fenollal, majd fenol és CHCI31:1 térfogatarányú keverékével végül kloroformmal extraháljuk. A nyert vizes fázist dializáljuk 10 mmól/liter Trisz (pH 8/-1 mmól/liter) EDTA oldattal szemben. A nyert vizes fázis ultraibolya abszorpciós mérése azt mutatja, hogy a HG-3 bakteriofág tiszta DNS-ét nyerjük. így 2920 pg HG-3-at, 1100 fxg HG-6-ot és 819 pg HG-7-et nyerünk. Southern módszerével összhangban (E.M. Southern: J. Mól. Bioi., 98,503 (1975) a nyert DNS-ek Southern foltképző analízisét végezzük el. A folyamatok és körülmények a következők: 1. DNS: HG-3 825 ng egyenként HG-6 935 ng egyenként HG-7 685 ng egyenként 2. Emésztés különböző restrikciós enimekkel: 10 egység Bam Hl, 10 egység Eco Rí, 10 egység Bam Hl + 10 egység Eco Rí; 28 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
