200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B nak vetjük alá, hogy sejt-szemcséket képezzünk. A felülúszót elöntjük, és LB tápközeget adunk hozzá és kevertetjük, hogy a sejt-szemcsék mindegyikét újra szuszpendáljuk. Az így létrejött szuszpenziók mindegyikét LB agar lemezre, amely 30 pg/ml tetraciklint is tartalmaz, inokuláljuk, majd 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubálunk. Végeredményben mind pR 18, mind pB 2-7, mind pB 2-2 plazmidokkal transzformált, tctraciklin-rezisztcns transzformánok telepeit nyerjük. 2. lépés pB 2-7 és pR 18 plazmid DNS előállítása ApB2-7, illetve pR 18 plazmidokkal transzformált transzformánsok, amelyeket az 1. lépésben nyertünk, mindegyikét a következő műveleteknek vetjük alá: (1) a transzformáns növesztése és a plazmid sokszorozása; (2) a transzformánsok kinyerése és lizise; és (3) a plazmid DNS tisztítása Maniatis és munkatársainak módszerével összhangban (T. Maniatis, E.F. Fritsch és J. Sambrook: Molecular Cloning, 88-96. oldal, kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory, USA). Bemutatásként ismertetjük, hogy minden egyes transzformánst LB tápközegre inokulálunk és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk élénk rázatás közben. Ezt a lépést megismételjük a transzformáns növesztésének és a plazmid sokszorozásának elérésére. A transzformáns tenyészetet centrifugálással nyerjük ki 4000 g-nél 10 percen át 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót elöntjük. Az Így létrejött üledéket 100 ml jéghideg STE-vel mossuk [0,1 mól/liter NaCl, 10 mmól/liter Trisz.HCl (pH 7,8) és 1 mmól/liter EDTA] és lizisnek vetjük alá forralással, 10 mmól/liter Trisz.HCl-ben (pH 8,0) levő 20 mg/ml lizozim alkalmazásával. A viszkózus terméket ultracentrifuga-csőbe visszük át, és 25 000 fordulat/perccel centrifugáljuk 30 percen át 4 °C hőmérsékleten, így egy DNS oldatot nyerünk. A DNS oldat térfogatát lemérjük. Minden milliliterhez 1 g szilárd cézium-kloridot adunk és enyhén keverjük, amíg az összes só fel nem oldódik. 0,8 ml etidium-bromid (10 mg) ml H20-ban) oldatot adunk minden 10 ml cézium-klorid oldathoz. Az oldat végső sűrűsége 1,55 g/ml, és az etidium-bromid koncentrációja kb. 600 pg/ml. A cézium-klorid oldatot átvisszük centrifugáláshoz alkalmas csőbe, és a cső többi részét könnyű paraffinolajjal töltjük ki. A centrifugálást 45 000 fordulat/percnél hajtjuk végre 36 órán át 20 °C hőmérsékleten, két DNS-csíkot nyerve, a felső csík tartalmazza a lineáris bakteriális DNS-t és az elmetszett cirkuláris plazmid DNS-t, és az alsó csíkját egy üvegcsőbe gyűjtjük egy injekciós tűn át, amely a cső oldalába van beépítve. Az etidium-bromidot eltávolítjuk, és a vizes fázist TAE ellen dializáljuk. A plazmid DNS oldatot RN- ázzal kezeljük, és azonos térfogat kiegyensúlyozott fenollal extraháljuk. A vizes fázist egy TAE-vel (pH 8,0) és 0,1% SDS-el kiegyenlített Bio-Gel A-150 oszlopra rétegezzük. Az oszlopon a DNS-t mossuk, és egy TE-t (0,1% SDS-el kiegészítve) tartalmazó tartályt szerelünk rá a frakciók gyűjtéséhez. A frakciókat etanollal kicsapjuk, így tiszta plazmid DNS-t nyerünk. A fenti folyamatot kivitelezve 250 pf tiszta pB 2-7 plazmid DNS-t és 134 pg tiszta pR 18 plazmid 25 DNS-t nyerünk. 3. lépés A tiszta pB 2-7 és pR 18 plazmid DNS-ek bemetszés (nick) transzlációja A 2. lépésben nyert tiszta pB 2-7 plazmid DNS- ből 40 (jLg-ot veszünk, emésztjük Pst I restrikciós enzimmel és elektroforézisnek vetjük alá 4%-os akrilamid-gélcn. Az elektroforézis után a DNS-t megfestjük és a kívánt csíkokat kivágjuk, hogy izoláljunk egy Pst I beiktatott részt (inzertet). 500 ng izolált Pst I beiktatott részt alkalmazva bemetszéses (nick) transzlációt hajtunk végre ugyanolyan módon, ahogyan ezt Maniatis és munkatársai leírtak [Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 72, 1184 (1975)]. A bemetszéses (nick) transzládóhoz a Nick Translation Kit-et (gyártja és forgalmazza: Bethesda Research Laboratories, Inc., USA), és 80 pmól radioaktív dCTP-t alkalmazunk 25 pl-es reakciórendszerben (440 Ci/mmól-nál). A keverékhez, amely tartalmaz 2.5 pl A oldatot (dNTP), 2.5 pl B oldatot (500 ng vizsgálati DNS, vagyis Pst I beiktatott rész) 5 pX ipe\£eTT o<}>opp 8XI1T—t (3200 XJpp X) I, 3 pl „hideg dCTP-t (65 pmól, 50 pmól/p.1 dCTP) II, 2 pl E oldatot (víz) vagyis 22,5 pl oldatot összesen, 2.5 pl C oldathoz adjuk (DN-áz, DNS polimeráz I), és reagáltatunk 15 °C hőmérsékleten 60 percen át. Ezután D oldatot (leállító puffer) adunk az így létrejött keverékhez, hogy leállítsuk a reakciót. Ezután hordozó (carrier) tRNS-t adunk hozzá, kétszer etanolos kicsapásnak vetjük alá és feloldjuk 500 pl vízben. A pg DNS-re vonatkoztatott fajlagos aktivitás 9,3.107 cpm. A 2. lépésben nyert tiszta pR 18 plazmid DNS tekintetében is a fentebb leírt folyamatot hajtjuk végre, hogy kivitelezzük a bemetszés (nick) transzlációt. A pg DNS-re vonatkoztatott fajlagos aktivitás 7.107 cpm. 4. lépés A pR 18 plazmid DNS Rsa I beiktatott fragmensének előállítása 80 y ttP 18 TrXot£pi8 AN2—t ep'<t£t vKPaal pEOTpiKXLaevSippeX, ,CTeXeKTpo<{)op'íioi'8KtiTeT9K aXN4% — oCTiroXLaKpiXapiS'y'Xev. AßeiKTaTorrp'a$EK (iv£eptek)k x t3jetke£ > KmNvTXOX(pctt,TüjRY<pUKKi,'tr TKTCTTípuKBNAoCTCXoTraeyTCT'y'tíieX. kb 640 bp 3,77 pg (52%-os kinyerés) kb 175 bp 1,77 pg (50%-os kinyerés). A fenti kb. 640 bp-s beiktatott részt a pR 18 3’ fragmensének jelöljük (amely a pR 18 3’-nem fordított területét jelenti), és a fenti mintegy 175 bp-s beiktatott részt pR 18-cfr-nek jelöljük (amely a pR 18 kódoló területét jelenti). Ezen túl a fenti folyamatot megismételjük, Pst I és Mst II restrikciós enzimekkel Rsa I restrikciós enzim helyett, hogy a kövektező csíkot nyerjük: kb. 450 bp 3,65 pg (60%-os kinyerés) A fenti beiktatott részt a pR 18 ő’-fragmensének jelöljük. 26 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
