200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B pB 2-7 és pR 18 plazmidot tartalmazó E. coli törzseket tenyésztünk 1 liter M 9 tápközegben, amely a (3) irodalmi helyen van leírva a 440. oldalon, a tápközeg még 10 |xg/ml tetraciklint is tartalmaz. Ezután a (3) irodalmi helyen, a 90. oldalon leírt eljárással összhangban a plazmidok mindegyikét izoláljuk kb. 150 p,g mennyiségben. Az egyes plazmidok beiktatásának (inzertjének) bázisszekvenicáját a Maxam-Gilbert kémiai eljárás szerint határozzuk meg (Maxam és munkatársai: Method in Enzimology, 55,490. oldal (1980), Academic Press). Az így meghatározott bázisszekvenciáról azt találjuk, hogy egyezésben van a 9. lépésben meghatározott részleges-szekvenciával. így a nyúl TNF teljes szekvenciáját tisztázhatnak lehet tekinteni. 15. lépés Ebben a lépésben egy plazmid megalkotását hajtjuk végre pR 12 rekombináns plazmidot alkalmazva, hogy a TNF közvetlen kifejlődését nyerjük lac-ot használva promotorként. A folyamatot a 2. ábra mutatja be. Először 10 p.g pR 12 plazmidot emésztünk 10 egység Apa U-el (gyártja és forgamazza: Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) 37 °C hőmérsékleten 2 órán át, és elektroforézisnek vetjük alá 4 súly%-os poliakrilamidgélen, így izolálunk 610 bp-es fragmenseket. Kb. 1 jig fragmenst izolálunk a gélről elektroelucióval. Azonos módon, mint a 10. lépésben, két oligonukleotidot, amelyeket a 2. ábrában mutatunk be, nevezetesen az 5’-GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3’-t és az 5’-CGAGAAGCTGACATG-3’-t, szintetizálunk. Ezután az oligonukleotidok (kb. 100 pmól) 5’ végeit foszforilezzük T4 polinukleotid kinázt alkalmazva a (3) irodalmi helyen, a 122. oldalon leírt módszerrel összhangban. A reakció teljessé válása után a reakciókeveréket fenollal, majd kloroformmal extraháljuk. Ezután a nyert szintetikus oligomereket összekeverjük 0,5 pg Apa I 630 bp-s fragmenssel és etanollal kicsapjuk. A fragmenst ligáljuk a szintetikus oligomerekkel 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át 10 egység T4 DNS ligázt alkalmazva az (1) irodalmi helyen, a 37. oldalon leírt eljárással összhangban. A reakció teljessé válása után a reakciókeveréket etanollal kicsapjuk és 20 egység Bam HI-vel emésztjük 37 °C hőmérsékleten három órán át, ezt követi az elektroforézis, amelyet 4 súly%-os poliakrilamid gélen hajtunk végre, így 670 bp-s fragmenseket nyerünk ki elektroelucióval. 1 jxg kereskedelmi forgalomban rendelkezésre álló pUC-8 plazmidot (4916. katalógusszám, gyártja és forgalmazza: P-L Biochemicals, Inc., USA) emésztünk Bam HI-val és extrahálunk fenollal, majd kloroformmal, ezt követi a kicsapás etanollal, így egy vektort nyerünk. 0,5 p.g így nyert vektort ligálunk a fentebb említett, mindkét végén Bam HI-val és extrahálunk fenollal, majd kloroformmal, ezt követi a kicsapás etanollal, így egy vektort nyerünk. 0,5 p.g így nyert vektort ligálunk a fentebb említett, mindkét végén Bam Hl helyekkel rendelkező s a TNF-et kódoló kb. 670 bp-t tartalmazó fragmenssel, T4 DNS ligázt alkalmazva. A (4) irodalmi hely 20. oldalán leírt eljárással összhang-21 ban E. coli JM 101-et transzformálunk a fentebb említett vektort alkalmazva és tenyésztünk 1 mmól/liter IPTG-t és 0,004% (súly/térf.) X-gal-t tartalmazó agar tápközegen, így kb. 200 db fehér telepet nyerünk. Ezek közül a transzformánsok közül 100-ból a plazmid DNS-t előállítjuk és Bam HI-val emésztjük. Ennek eredményeként azt találjuk, hogy 15 plazmid tartalmazza a szóban forgó Bam Hl fragmenst (kb. 670 bp). Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a beiktatás irányát, a fenti 15 plazmidot EcoRI-vel emésztjük, amelynek csupán egy felismerő helye van pUC-8-on és Pvu Il-vel, amelynek csupán egy felismerő helye van a 670 bázispár fragmens-részen, majd elektroforézisnek vetjük alá 6 súly%-os poliakrilamid gélen. Végeredményben megállapítjuk, hogy 7 plazmid rendelkezik a szóban forgó, kb. 140 bp-t tartalmazó fragmenssel, és hogy a lac promoter átírási iránya a pUC-8-on egyezésben van a TNF-et kódoló oligodezoxinukleotidok irányával. A DNS szekvencia-elemzés megmutatja, hogy ennek a héz plazmidnak azonos a szekvenciája és a kívánt nukleotid-szekvenciával rendelkezik a lac promotor, szintetikus DNS és cDNS közti elágazásoknál. 16. lépés A további plazmidok megalkotását a pR 17 rekombináns plazmidot alkalmazva hajtjuk végre abból a célból, hogy a TNF közvetlen kifejeződését kapjuk, lac UV5-öt alkalmazva promotorként. A folyamatot a 3. ábra mutatja be. Először 10 jig pR 17 plazmidot emésztünk 10 egységApa I-el (gyártja és forgalmazza: Bethesda Research Laboratories, Inc., USA) 37 °C hőmérsékleten 2 órán át, és elektroforézisnek vetjük alá 4 súly%-os poliakrilamidgélen, hogy olyan fragmenst izoláljunk, amely kb. 630 bp-t tartalmaz. A fragmens mintegy 1 jxg-ját izoláljuk a gélről elektroelucióval. Azonos módon, mint a 10. lépésben, két oligodezoxinukleotidot, amelyek a 3. ábrában vannak bemutatva, nevezetesen az 5’-AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC- 3’-t és 5’-CGAGAAGTCGACATG-3’-T, szintetizálunk. Ezután a két oligodezoxinukleotid 5’ végeit foszforilezzük, T4 polinukleotid kinázt alkalmazva a (3) irodalmi hely 122. oldalán leírt módszerrel összhangban. A reakció teljessé válása után a reakciókeveréket fenollal, majd kloroformmal extraháljuk. Ezután a szintetikus oligomereket összekeverjük a korábban nyert, pR 17 fragmensből előállított Apa I fragmenssel (kb. 630 bp), és etanollal kicsapjuk. A fragmenseket a szintetikus oligomerekkel ligáljuk 4 °C hőmérsékleten, 10 egység T4 ligázt alkalmazva az (1) irodalmi helyen, a 37. oldalon leírt eljárással összhangban. A reakció teljessé válása után a reakciókeveréket etanollal kicsapjuk és 20 egység £coRI-vel emésztjük 37 °C hőmérsékleten 3 órán át, ezt követi az elektroforézis, amelyet 4 súly%-os poliakrilamid-gélen hajtunk végre, így egy fragmenst (kb. 670 bp) nyerünk ki elektroelucióval. Az F. Fuller által leírt [Gene, 19,42-54 oldal (1982)] eljárással összhangban készítjük el a p0595- 15 plazmidot. 1 pg p0595-15-öt emésztünk £coRI-vel, és fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, ezt követi a 22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
