200931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású nukleozidok előállítására
HU 200931 B adunk 35 ml 10 mmólos kálium-foszfát puffert, amely még 0,04% kálium-azidot is tartalmaz (pH = 6,8), majd 5000I.U. tisztított timidin-foszforilázt és 10 000 I.U. purin-nukleozid-foszforilázt (Krenitsky és munkatársai, Biochemistry, 20,36151981 és 4,381,444 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) adagolunk a szuszpenzióhoz 5 ml DEAE gyantán abszorbeálva, és a kapott anyagot 35 °C hőmérsékleten keverjük. A 12. napon további 5000 I.U. tisztított timidin-foszforilázt és 10 000 I.U. purin-nukleozid-foszforilázt adagolunk hozzá 5 ml DEAE gyantán abszorbeálva és a keverést tovább folytatjuk. A 13. napon a reakciókcvcréket leszűrjük, a szűrletet egymás után kapcsolt oszlopokra adagoljuk. Az első oszlop 2,5 x 20 ernes, Dowex-l-hidroxid-töltetű, a második oszlop 2,5 x 10 cm méretű és a töltete Amberlite XAD-2 gyanta. A minta felvitele után az oszlopokat nagy mennyiségű vízzel átmossuk és a terméket metanollal eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókhoz kb. 5 ml vízmentes szilíkagélt adunk, az oldószert vákuumban elpárologtatjuk és ezt a szilikagélt egy 2,5 x 50 cm méretű szilikagél töltetű oszlopra visszük és kloroform/metanol = 9/1 eleggyel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, a visszamaradó szilárd anyagot 10 ml 95%-os etanolban oldjuk, az oldószert vákuumban eltávolítjuk és a terméket ismételen 10 ml 95%-os etanolban oldjuk. Szűréssel a szilikagél nyomokat is eltávolítjuk, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a terméket vízben oldjuk, majd liofilizáljuk. Ily módon 0,084 g cím szerinti vegyületet nyerünk. Elemanalízis a C13H16FN5O2 összegképletű vegyületre: Számított: C% = 53,24, H = 5,50, N% = 23,88, F% = 5,48, Mért: C% = 53,42, H% = 5,56, N% = 23,73, F% « 6,26. 9. példa 2-amino-6-metoxi-9-(béta-D-2’,3’-didezoxi-3’-f luor-ribofuranozil)-9H-purin 0,51 g (3,1 mmól) 2-amino-6-metoxi-purint (előállítása: 2-amino-6-klór-purinból nátrium-metoxiddal végzett nukleofil helyettesítéssel) és 0,35 g (1,3 mmól) 2’,3’-didezoxi-3’-fluor-timidint feloldunk 5 ml N\N’-dimetil-formamidban és 5 ml dimetil-szulfoxidban, majd hozzáadunk 30 ml 10 mólos kálium-foszfát puffert (pH = 6,8, 0,04% kálium-azid), majd 3300 I.U. tisztított timidin-foszforilázt és 6900 I.U. purin-nukleozid-foszforilázt 3 ml DEAE gyantán abszorbeálva és a kapott szuszpenziót 35 °C hőmérsékleten keverjük. 6 nap elteltével további 3300 I.U. tisztított timidin-foszforilázt és 6900 I.U. purin-nukleozid-foszforilázt adagolunk hozzá 5 ml DEAE gyantán abszorbeálva és a keverést tovább folytatjuk. További 7 nap elteltével 3300 I.U. tisztított timidin-foszforilázt és 6900 I.U. purin-nukleozid-foszforilázt adagolunk hozzá 5 ml DEAE gyantán abszorbeálva. 23 nap elteltével (a teljes reakcióidő36 nap) a reakciókeveréket leszűrjük, a szűrletet egymás után kapcsolt oszlopokra adagoljuk. Az első oszlop 2,5 x 10 cm méretű és a töltete Dowex-l-hidroxid, a második 2,5 x 10 mérc-9 tű és töltete Amberlite XAD-2 gyanta. A minták felvitele után az oszlopokat nagymennyiségű vízzel átmossuk és a terméket metanollal eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókhoz kb. 5 ml vízmentes szilikagélt adunk, az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, az így kapott szilikagélt egy 2^ x 50 cm méretű, szilikagél töltetű oszlopra adjuk és az eluálást kloroform/metanol = 9/1 eleggyel végezzük. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, a visszamaradó szilárd anyagot 10 ml 95%-os etanolban oldjuk, az oldószert ismételten vákuumban elpárologtatjuk és a visszamaradó anyagot 10 ml 95%-os etanolban oldjuk, majd a szilikagél nyomok eltávolítására szűrjük. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, a terméket vízben oldjuk és liofilizáljuk. Ily módon 0,204 g cím szerinti vegyületet nyerünk. Elemanalízis a C13H16FN5O2 összegképletű vegyületre: Számított: C% = 46,64, H% = 4,98, N% = 24,72, F% 6,71, Mért: C% 46,10, H% = 5,09, N% 23,%, F% 6,74. A termék szerkezetét 1H-NMR spektrummal és tömegspcktrummal igazoltuk. 10. példa 6-ciklopentiloxi-9-(béta-D-23-didezoxi-3-fluo r-ribofuranozil)-9H-purin 1 g (4,9 mmól) 6-ciklopentil-oxi-purint (előállítása 6-klór-purinból) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) nátrium-hidriddel végzett nukleoful helyettesítéssel) és 0,5 g (2,1 mmól) 2’3’-didezoxi- 3’-lluor-timidint 5 ml N’.N’-dimetil-formamidban és 5 ml dimetil-szulfoxidban szuszpendálunk és hozzáadunk 35 ml 10 mólos kálium-foszfát-puffert (pH = 6,8, 0,04% kálium-azid), majd 5000 I.U. purin-nukleozid-foszforilázt. 5 ml DEAE gyantán abszorbeálva és a kapott szuszpenziót 34#C hőmérsékleten keverjük. 35 nap elteltével további 3000 I.U. tisztított timidin-foszforilázt és 60001.U. tisztított nukleozid-foszforilázt (3 ml DEAE gyantán abszorbeálva) adagolunk, majd további 21 napig keverjük. Ezután a reakciókeveréket szüljük, a szűrletet két egymás után kötött oszlopra adagoljuk. Az első oszlop 24 x 10 cm méretű és AG1-X2 (OH-forma) töltetű, míg a második 24 x 20 cm mérető és Amberlite XAD-2 gyanta töltetű. A minta felvitele után az oszlopokat nagy mennyiségű vízzel átmossuk és a terméket metanollal eluáljuk. A terméket ezután szilikagél oszlopon flash-kromatografáljuk (szilikagél, 2,5 x 48, diklór-metán/mtanol = 9/1). Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a temréket vízben oldjuk és liofilizáljuk. Ily módon 0,162 g cím szerinti vegyületet nyerünk. Elemanalízis a C15H19FN4O3 összegképletű vegyületre: Számított: C% = 55,89, H% = 5,94, N% = 17 38 Mért: C% = 56,01, H% = 5,94, N% = 17,20. A termék szerkezetét tömegspektrummal és NMR spektrummal igazoltuk. 11. példa 6-izopropoxi-9-(bcta-D-2,3-didezoxi-3-fluor-ri 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
