200799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nisztatin előállítására
1 HU 200799 B 2 Találmányunk tárgya eljárás nisztatin termelés fokozására mikrobiológiai úton, Streptomyces noursel ssp. albidus alfajhoz tartozó, az MNG-00255 törzzsel, aerob fermentációval, asszimilálható szén- és nitrogén-forrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon, oly módon, hogy az alkalmazott táptalajhoz és/vagy a fermentlebe egy alkalommal vagy több részletben, 0,5—2,0 tf%—nyl mennyiségben, 1 —4 szónatomszámú alkanolokat, előnyösen etanolt, n-propanolt, izopropanolt adagolunk, majd a fermentáció folyamán keletkezett antibiotikumot a fermentléből elkülönítjük. Ismeretes, hogy nisztatin előállítására a legújabban a Streptomyces noursel ssp. albidus MNG-00255 számú törzset, illetve ennek utódait (NXO-52 és NXO-54 jelzésű tenyészetek az MNG-00255 törzs egyszerű továbbtenyósztései) használják (193051 lajstromszámú magyar szabadalom). Az alkalmazott új törzsnek, illetve speciális módon, szelektív táptalajok használata révén előállított utódainak fermentálásával a nisztatin termelés üvegfermentorban pl. 87800 E/ml — 92400 E/ml, illetve 145700 E/ml, a fermentációs táptalaj összetételétől és a fermentációs táptalaj összetételétől és a fermentáció egyéb körülményeitől függően. Kísérleteink során — figyelembe véve a polién antibiotikumok bioszintézisét — vizsgáltuk különböző adalékanyagok (mint esetleges prekurzorok) hatását a nisztatin termelésre. Kísérleteinkben azt a meglepő megfigyelést tettük, hogy alacsony szénatomszámú alkoholok adagolása a táptalajba fokozza a nisztatin bioszintézisét. Ilyen hatásra a szakirodalomban a Streptomyces nemzetség esetében csak az eritromycint termelő S. erythreus és az oleandomycint termelő S. antibioticus esetében található utalás propilalkohol alkalmazásával (Antib. 1962.711. 957—962). Ugyanakkor ilyen hatás elérése céljából sem más alkohol alkalmazására, sem más Streptomyces faj, sem más antibiotikum esetében nem található utalás az irodalomban. A kísérletek során vizsgáltuk a metanol, etanol, n-propanol, izo-propanol, butanol hatását, rázóasztalon történő tenyésztéssel (400 fordulat/perc, 2,54 cm lökethossz), 28'C-on. Az alkalmazott inokulum táptalaj összetétele: Kukoricaliszt 30 g kukoricalekvár 5 g ammóniumnitrát 4 g kalciumkarbonát 10 g nátriumklorid 2 g kalcium-dihidrogénfoszfát 1 g csapvíz 1000ml pH: 6,2—6,4 (150 ml-es Erlenmeyer lombikban 25—25 ml steril táptalaj) A fermentációs táptalaj összetétele: glükóz 75 g kukoricalekvár 5 g ammóniumnitrát 8 9 szójaliszt 18 g kalciumkarbonát 7 g csapvíz 1000ml pH: 6,1—6,3 (150 ml-es Erlenmeyer lomblk-ban 25—25 ml steril táptalaj) Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze: Kontroll (adagolás nélkül) 60700 E/ml 1 tf°/o metanol 65200 ” 1 tf% etanol 86200 * 0,5 tfo/o etanol 73600 ” 2,0 tf% etanol 84300 " 1 tf% n-propanol 79800 ” 1 tf% izopropanol €2500 ” 1 tf°/o butanol 68100 ” Ugyancsak vizsgáltuk az alkoholok hatását üvegfermentorban, egy másik összetételű fermentációs táptalajt alkalmazva: Búzakeményítő 560 g szójaliszt 64 g ammóniumnitrát 32 g kalciumkarbonát 40 g nátriumklocid 16 g trinátriumfoszfát 3,2 g pálmaolaj 32 g víz 8000 ml pH: 6,1—6,3 Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Kontroll (adagolás nélkül) 85100 E/ml 1 tf% metanol 90600 ” 1 tf°/o etanol 112400 ” 1 tfo/o n-propanol 102200 ” I tf% izopropanol 98800 ” 0,5 tf% etanol és a fermentáció folyamán további 0,5 + 0,5 tf% etanol 109200 " 0,5 tf% etanol 104700 ” 2,0 tf% etanol 102100 ” 0,5 tf% izopropanol 101200 " Találmányunk szerint tehát nisztatin termeiésének fokozására úgy járunk el, hogy a Streptomyces noursel ssp. albidus alfajhoz tartozó törzs fermentációjánál a táptalajba, és/vagy a fermentáció folyamán a fermentlébe, 0,1—2,0 tf%-nyi mennyiségben 1—4 szénatomszámú alkoholokat adagolunk. Mikroorganizmusként a Streptomyces noursei ssp. albidus MNG-00255 számon letétbe helyezett törzs tenyészeteit alkalmazzuk. A táptalaj asszimilálható szén- és nitrogénforrást, előnyösen szójalisztet és/vagy kukoricalekvárt, amilázzal elfolyósított kukoricalisztet és/vagy keményítőt és ásványi sókat, előnyösen ammonium-, kálcium-, kálium-, nátriumsókat tartalmaz, a fermentációt aerob körülményék mellett, 25—35°C között, előnyösen 28—30°C-on vitelezzük ki, majd a keletkezett antibiotikumot a fermentléből elkülönítjük. Kísérleteinkben a nisztatin mennyiségi meghatározását spektrofotometriásán, a nisztatinnak az ultraibolya fényben mérhető elnyelési maximumai alapján határoztuk meg (Analytical Profiles of Drug Substances, 6. kötet, Academic Press 1977), illetve az Amerikai Egyesült Államok gyógyszerkönyvének XXI. kiadása alapján, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
