200796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli kromoszómába történő nukleotid szekvencia beépítést biztosító expresszios vektorok előállítására
3 HU 200796 A 4 A találmányunk szerinti pozitív szelekciós módszer egységnyi Idő alatt 3—4 nagyságrenddel több klón átvizsgálását teszi lehetővé; mint az eddig ismert, negatív szelekción alapuló eljárások. A találmányunk szerinti megoldás további, nagy jelentőségű vonása az, hogy a kromoszómán átalakított gén ép kópiáját még létfontosságú gén esetén sem kell külön bejuttatni a sejtbe, hiszen az a kettős rekombinációs esemény megtörténtének pillanatában a plazmidon automatikusan kialakul. A találmány szerinti megoldást sokoldalúan lehet hasznosítani. Az alábbiakban röviden ismertetjük a legfontosabb felhasználási területeket. 1. Tetszőleges DNS fragment célzott bejuttatása a hordozó sejt kromoszómaállományába. Az ismert módszerekkel ellentétben alig korlátozottak lehetőségeink a bejuttatás helyére nézve, a találmány szerinti plazmidba beépítendő kromoszómarészlet kiválasztásánál csak arra kell figyelemmel lenni, hogy az nem tartalmazhat transzkripciós terminátort. Megjegyezzük továbbá, hogy eljárásunkkal — hasonlóan az összes eddigi eljáráshoz — csak transz helyzetben komplementálható létfontosságú génekbe juttathatunk be DNS fragmentet. 2. Plazmid stabilizálás, létfontosságú gén útján A találmány szerinti plazmidkonstrukcló nagy előnye az, hogy lehetővé teszi, hogy a kettős rekombinációs esemény megtörténte után a plazmidon kialakuljon a kromoszómán elrontott gén másolata, s így a plazmid a sejt számára elveszthetetlenné válik, hiszen a plazmid elvesztése most már az esszenciális génfunkció megszűnését eredményezné. így rendszerünk alkalmazásával tetszőleges plazmidokat, például expressziós vektorokat stabilizálni lehet plazmldvesztés ellen. Ez a módszerünkből származó legnagyobb gazdasági jelentőségű következmény, hiszen a fermentációk során szükségtelenné teszi a rendkívül költséges antibiotikum szelekciót. 3. Génfunkció elvesztését követő események vizsgálata A találmány szerinti eljárással természetesen felépíthető olyan mesterséges operon is, amely regulálható promoted tartalmaz. Ebben az esetben a kérdéses génfunkció szabályozhatóvá válik. Például ha á sejtet olyan körülmények közé helyezzük, ahol a promoter nem működik, lehetőségünk nyílik a létfontosságú génfunkció elvesztését Időben közvetlenül követő események vizsgálatára. így a találmány szerinti megoldás egyaránt alkalmazható valamely kromoszómális gén inaktiválására, illetve a génfunkció szabályozhatóvá tételére. Az új konstrukciójú plazmldok előállítására szolgáló eljárás, illetve a megfelelően átalakított kiónok elválasztására szolgáló eljárás főbb lépéseit a következőkben Ismertetjük. Első lépésként valamely plazmidon — az in vitro DNS rekombináció eszközeivel — létrehozunk egy két génből álló (A és Rí — lásd 1. ábra) mesterséges bakteriális operont. Az 1. ábra szerinti megoldásnál a „Pr” promoter egy kétcisztroros — A és Rí — messenger RNS szintézisét vezérli, amelyről akadálytalanul kifejeződik az R antibiotikum rezisztencia gén, így a plazmiddal transzformált baktérium sejt mindkét (Rí és R2) antibiotikumra rezisztens. Második lépésben az „A" célszekvencia belsejébe klónozzuk az integrálandó „B” gént, amelyet egy „T” terminátor szekvencia követ — lásd 2. ábra. (Speciális esetekben elegendő pusztán a „T terminátor szekvencia klónozása.) A 2. ábra szerinti Plazmid/2-vel transzformált sejt szenzitív lesz az Rí antibiotikumra, minthogy a Pr prometerről induló transzkripció a T terminátoron stoppolódik. A plazmid az R2 antibiotikum segítségével tartható fenn. Amennyiben a 3.a és 3.b ábrán vázolt kettős rekombinációs esemény lejátszódik és a „B” DNS szakasz a terminátorral együtt a kromoszómán lévő „A” szekvenciába integrálódik, ebben az esetben a plazmidon visszaalakul az 1. ábrának megfelelő állapot és újból megnyilvánul az Rí antibiotikum rezisztencia. így a kettős rekombinációs esemény megtörténte könnyen nyomonkövethető. A 2. ábrának megfelelő intermedier plamldot (plazmid12) tartalmazó rec+ (rekombinációra képes) kiónt, előnyösen E. coli törzset, az R2 antibiotikumon növesztjük, majd 150-200 pj overnight kultúrát Rí antibiotikumot tartalmazó táptalajra szélesztünk. Az Rí antibiotikumos lemezen csak a kívánt kettős rekombináció során keletkező, Rí antibiotikum rezisztens klórok nőnek ki. A kettős rekombinációs esemény gyakorisága az „A" szekvencia „B+T” inszertet megelőző, illetve azt követő részének a hosszúságától függ. Ha mindkét szakasz több mint 300—400 bázispár hosszúságú, akkor a rekombinációs frekvencia az irodalmi adatok alapján >10“5/sejt. A 200 (xl overnight kultúra kb. 107 sejtet tartalmaz, így lemezenként — durva becslés alapján — kb 100 pozitív klón jelenik meg. A találmányunk további részleteit az alábbi példákon szemléltetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákban ismertetettekre korlátoznánk. 1. példa A plazmid kialakítása A pERVI/23 PLH4 plazmid (NCAIM B (P)001016) egyedi Cla I restrikciós helyére klónoztunk egy 750 nukleotidos Tag I restrikciós fragmentet, amely a PBR329 plazmidbói (MNG 00299) származott és a CAT gént tartalmazza a saját promotere nélkül. A plazmidot tartalmazó kiónok kloramfenikol rezisztensek voltak. — Intermedier I Az eredményül kapott plazmidot Xba enzimmel emésztettük, majd a linearizált plazmidot Bal 31 exonukleázzal kezelve — a Xba I helytől 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
