200796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli kromoszómába történő nukleotid szekvencia beépítést biztosító expresszios vektorok előállítására
5 HU 200 796 A mindkét Irányban — mintegy 20—20 nukleotidot eltávolítottunk. Ezáltal elimlnáltuk a plazmidról a Hindi ll es Bgl II restrikciós helyeket, és így az a-peptid és a CAT gén közötti Hind III hely egyedivé vált. — Intermedier II A pNo2016 plazmldból (Proc.Natl.Acad.Scl. USA, 1696—1701 (1979)) kivágtunk egy 1300 nukleotid hosszúságú EcoR I, Hph I fragmentet, amely az L10 riboszomális fehérje gén 3’ részét és az intakt L1 riboszomális fehérje gént tartalmazta. A fragmentet T4 polimeráz és Klenowpolimeráz enzimekkel kezeltük, a ragadós végeket ezáltal tompa végekké alakítva, majd a fragment mindkét végéhez Hind III linkért ligáitunk, és ezt követő Hind III emésztés után a fragmentet az Intermedier II plazmid egyedi Hind III helyére klónoztuk. Helyes orientációjú beépülés esetén a mesterséges operon 3 gént tartalmazott: a-L10 fúziós gén, L1 gén CAT gén. A plazmiddal transzformált sejtek továbbra is kloramfenikol rezisztenciát mutattak. — Intermedier III Az intermedier III plazmid egyedi Bgl ll helyére (az L1 gén belsejében található) beklónoztunk egy 320 nukleotid hosszúságú — Bam Hl linkerekkel ellátott — DNS fragmentet, amely az rrnB operon Ti és T2 terminátorát tartalmazta. — a plazmldot a következő névvel láttuk el: pER 23"C”L1TiT2 Kloramfenikol szenzitív kiónokat izolálva utóbb kiderült, hogy bennük tandem 2 vagy 3 terminátor fragment van. Egy fragment beépülése esetén a kiónok még nőttek kloramfenikolon. Mindez azonban a plazmidok használhatóságát nem befolyásolta. A plazmidok tényleges szerkezetét restrikciós enzimekkel történő térképezéssel, valamint DNS szekvencia meghatározással állapítottuk meg. A kísérletet elvégezve (növesztés YTB + ampicillinen, majd szélesztés kloramfenikolra), sikerült kloramfenikol rezisztens, rekombináns kiónokat izolálnunk. A rekombináns kiónokat ún. „genom southern" technikával ellenőriztük, és igazoltuk, hogy a kromoszómán lévő L1 gén valóban tartalmazza a T1T2 terminátor inszertet. Az antibiotikum nélkül növesztett rekombináns kiónok 24 óra elteltével Is 10C%-ban megőrizték plazmidjukat, szemben a kontroll kiónok 45%-ával. Vegyszerek és preparátumok Az általánosan használt laboratóriumi vegyszerek alt. minőségű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, REANAL, SIGMA és MERCK készítmények voltak. A [a“32 P ATP és a~32 P dATP] preparátumok (Magyar Izotóp Intézet, Budapest) specifikus aktivitása 100—150 TBq/mM volt. A használt BamH I, EcoR I, Hind III, Bgl II, Xba I, restrikciós endonukleázokat az MTA SZBK Biokémiai Intézet Nukleinsav csoportjának munkatársai tisztították a közölt módszerek alapján [Methods in Enzimology (Ed: L.Grossmann, V.Moldave) Vol. 65. pages 89—180] A Cla I, Taq I, Hph I enzimek a New England Biolabs készítményei voltak. A BAL31 nukleáz és Klenow-enzim (E. coli DNAP-polimerasel Large Fragment) New England Biolabs, a bakteriális alkalikus foszfatáz (BAP) Worthington, a pankreász RN-áz és lizozim pedig REANAL készítmény volt. A T4 indukált polinukleotid ligáz Murray et al. módszere szerint készült [Murray, N.E., Bruce S.A. and Murray, K. Molecular cloning of the DNA ligásé gene from bacteriophage T4. J. Mol. Biol. 132 (1979) 493—505], Törzsek E. coli K12 JM107 [Yanisch-Perron, C. és mtsai: Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nukleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1985) 103—119], Az Escherichia coli törzsek növesztésére használt komplett folyadék táptalaj literenként 10 g Bacto-tryptone-t, 5 g Bacto Yeast extractot és 5 g NaCI-ot tartalmazott. Szilárd táptalaj készítéséhez a fenti összetételű médiumot literenként 15 g Bacto-agarral egészítettük ki. A ß-lactamäz gént kódoló plazmidot tartalmazó sejteket 100 ^g/ml koncentrációban ampicillint tartalmazó táptalajon növesztettük. Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó baktérium törzset 100 ^g/ml ampicillint tartalmazó táptalajon tenyésztettük és OD600nm 0,7—0,8 elérésekor 170 ^g/ml kloramfenikolt adtunk a kultúrához a plazmid amplifikálására. Preparatív méretekben történő plazmid DNS izoláláskor a Clewell és Helsinski által leírt módszerrel clear lizátumot készítettünk [Clewell, D B. and Helsinski, D.R., (1969) Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular RNA form. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 62,1159-1166], majd a plazmid DNS-t Sephacryl S1000 (Pharmacia) oszlopon vagy céziumklorid-ethidiumbromid sűrűség gradiensben ultracentrifugálva tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálásra (1,0—1,5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóim és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowicz által módosított kállum-acetátos módszert alkalmaztuk [Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York], DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England Biolabs által javasolt reakció körülmények között történt. Egyesszálú végeket tartalmazó DNS fragmentumok tompa végűvé alakítására a restrikciós enzimmel végzett hasítás után a DNS-t alkohollal kicsaptuk, majd 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 7 mM MgCl2 1 mM dithiothreitol, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 TTP összetételű pufferben [végtérfogat 10—20 jxl, DNS koncentráció 200—250 fj.g/ml] oldottuk és 1 —2 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentummal 15 percet, 37°C-on inkubáltuk. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
