200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
17 HU 200795 B 18 sávot elhasitottunk, eluáltunk és tisztítottunk. Azonos eljárást követve, egy 1300 bp-s DNS fragmenst nyertünk ptPBM-1 emésztésével BamHi-vel és Narl-el. Az 519 bp-s és 1300 bp-s DNS fragmensek ekvimoláris menynyiségeit alkalmaztuk ligáláshoz, Goodman H. M. és MacDonald R.J. standard módszerét [Method, Enzymol. 68, 75 (197-9)] követve. A ligációs keveréket kétszer extraháltuk fenol/kloroform 1:1 eleggyel, és a DNS-t kétszeres térfogatú abszolút etanollal kicsaptuk. Az üledéket feloldottuk 50 pl H20-ban, majd a DNS-t BamHI-vel emésztettük standard meghatározási körülmények között, és elkülönítettük elektroforézissel lX-os agaróz gélen. Egy 1819 bp-s DNS fragmenst kihasítottunk, eluáltuk a gélről és tisztítottuk. Ez a DNS fragmens tartalmazza az összes kódoló információt, amely a szignál peptidhez (20 aminosav) és az 573 aminosavból álló érett hibridhez vagy hármas-horgot tartalmazó PA molekulához szükséges, ez a molekula megfelel az 1(a) ábrán bemutatott (UKaa1_l31-Ser-Glu- Gly-A6n-Ser-Asp)1_91-t-PA-nak. A hármas-horog gént ezután BglII-vel hasított szarvasmarha papilloma virus (BPV) kifejeződő vektorhoz ligáltuk, amely mint komplett kifejeződő vektor szolgál. Hagyományos tenyésztés az 1(a) ábra szerinti hármas-horgot tartalmazó plazminogén aktivátort eredményezi. Urokináz horog szekvencia megalkotása A 2. és 3. példákban csak az urokináz horog-részét (a.a. 50-131) használjuk és iktatjuk be a t-PA kettős horog területe előtt vagy után. A 6. ábra mutatja be egy olyan nukleotid szekvencia megalkotását a pUK 53 rekombináns plazmidból, amely az 51- -131 aminosavakat kódolja. Itt van egy kellemes restrikciós hely, az MstI, éppen a 131. aminosavnak megfelelő nukleotid szekvencia után. Semmi sem található azonban az 50. aminosav körül. így az 50. aminosav körül egy restrikciós helyet alakítottunk ki (ebben a példában Ndel), amit vázlatosan, a 6. ábra szemléltet. Az urokináz horog-területe megfelel a 284 bp-től (50. aminosav) az 530 bp-ig (131. aminosav) terjedő nukleotid szekvenciának. Mintegy 10 pg pUK 53 piazmíd DNS-t emésztettünk teljességig Scal-el, amely a 204 bp-nál hasítja az urokináz szekvenciát. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS üledéket feloldottuk 50 pl pufferoldatban [10 mmól/1 CaCk, 12 mmól/1 MgClz; 0,2 mól/1 NaCl:. 1,20 mmól/1 trisz-HCL (pH 8,0), 1 mmól/1 EDTA]. A reakciókeverékhez 1 pl (2 egység) Bal 31 nukleázt adtunk, és a keveréket 30 "°C hőmérsékleten inkubáltuk 15 másodpercen át [Legerski R.J., Hadnett J.L. és Gray H.B.Jr.: Nucleic Acid Res. 5, 145 (1978)]. A reakciót 5 pl 0,4 mól/l-es EGTA hozzáadásával állítottuk le. Ezt a reakcióidőt alkalmasnak találtuk kb. 80 bp eltávolítására a DNS fragmens mindegyik végéről. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t egy oligonukleotid kapcsolóhoz (10 bp) ligáltuk standard reakciókörülmények között. A TGGAATTCCA szekvénciájú oligomer kapcsolót (EcoRI)Ndel kapcsoló) úgy terveztük meg, hogy egy Ndel hely (CATATG) alakuljon ki, amikor a TATG szekvenciát (amely az 51. aminosavnak felel meg) tartalmazó DNS fragmens véghez ligáljuk. Ezen felül a EcoRI restrikciós helyet is beépítettük a kapcsolóba a későbbi pUC 13 vektorba történő klórozáshoz. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t EcoRI-vel emésztettük, és 1%-os preparativ agaróz gélen végzett elektroforézissel szeparáltuk. Egy 340 bp-nek megfelelő DNS csikót kivágtunk, eluáltunk és etanollal kicsaptuk. Mintegy 40 ng ilyen DNS-t ligáltunk mintegy 0,4 pg, EcoRI-vel hasított pUC 13 vektor DNS-hez, és ezt használtuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására (Maniatis fentebb idézett munkája, 250. oldal). Mintegy 1000 rekombináns telepet nyertünk 10 lemezről. A bakteriális telepeket replika-lemez módszerrel nitro-cellulóz papírra vittük, és in situ hibridizélással átvizsgáltuk, radioaktív oligonukleotid vizsgáló mintát alkalmazva [Grunstein és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sei USA, 72, 3961 (1975)}. Az alkalmazott oligonukleotid vizsgáló minta 18 bp hosszúságú (TTCCATATGAGGGGAATG) volt, és az Eco RI/Ndel kapcsolóból származó első öt nukleoditot és az urokináz szekvenciából származó következő 13 bázist (amely az 51-54 aminosavaknak felel meg) tartalmazta. Mintegy 12 klón mutatott mérsékelttől-erös jelet röntgenfilmen. Ebből a 12 kiónból készített miniplazmid DNS-t Ndel-el emésztettük, és elektroforézissel szeparáltuk 1%-os agaróz gélen. Egy kiónról, a pUKKNdl6-ról azt találtuk, hogy tartalmazza az újonnan létrehozott Ndel helyet. Ezt a plazmid DNS-t, Ndel-el- és Mstl-el végzett emésztés után, elektroforézissel szeparáltuk 1,4%-os agaróz gélen, és Így egy 246 bp-s DNS fragmenst nyertünk. Ez a DNS fragmens tartalmazza az 51-131 aminosavakat kódoló urokináz nukleotid szekvenciát. A hiányzó 50. (Cys) aminosavhoz tartozó DNS szekvencia beépül az oligomer kapcsolóba, amint ezt a 7. és 8. ábra mutatja. 2. példa 91-(UKaa?°-l31-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-92--t-Pa Az 1(b) ábrán bemutatott urokináz horog szekvenciát beiktatjuk a t-PA kettős horog területe elé, vagyis a 91. és 92. aminosavak közé. Amint az előző példában leírtuk, a pUKKNd 16 plazmid DNS Ndel és MstI emésztése egy 246 bp-s szekvenciát hoz létre, 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
