200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
19 HU 200795 B 20 amely az urokináz 51-131. aminosavainak felel meg. Az UK horog szekvencia (246 bp) két végét két oligonukleotid kapcsolón keresztül beiktattuk a t-PA génbe a 462. (91. aminosav) és 463. (92. aminosav) nukleotidok közé. A követett eljárást a 7. ábra mutatja be. Mintegy 50 pg ptPBM-1 plazmid DNS-t emésztettünk EcoRI-vel, és egy 740 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroforézissel 1%-os agaróz gélen. Ezt a DNS-t azután Sau 961-el (az Asu 1 izoskizoraerje) részlegesen emésztettük egy 385 bp-s DNS fragmens izolálásához és tisztításához. Két komplementer oligonukleotid szekvenciát szintetizáltunk a foszfotriészter módszerrel [Crea és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sei. (USA), 75, 5765 (1978)], amely oligonukleotidok a t-PA 91. aminosavát (Thr) és az urokináz horog 50. aminosavát (Cys) kódolják: Thr Cys GGCC ACC TGC ■ G TGG ACGAT - 5’ Asul Ndel Az oligonukleotid kapcsoló Asul és Ndel restrikciós helyekkel van szegélyezve. Csak a felső oligonukleotid (GGCCACCTGC) van foszforilezve 5’ végénél. Mintegy 1 pg 385 bp-s DNS fragmenst ligáltunk egy éjszakán át mintegy 1 pg oligomer kapcsolóval. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t 2 órán ét emésztettük EcoRI-vel, és elektroforézissel 1,2%-os agaróz gélen, egy 394 bp-s DNS fragmenst választottunk el. Ez a DNS fragmens tartalmazza a szignál peptidet (35 aminosav) és a t-PA N-terminális 1-91. aminosavait kódoló nukleotid szekvenciákat. Ezen kívül helyreállítja az UK horog 50. aminosavéhoz (Cys) tartozó DNS szekvenciát amely nincs jelen 246 bp-s DNS fragmensében' (6. ábra). Abból a célból, hogy a t-PA szekvencia C-terminélisát megkapjuk, 92 aminosavval előre, mintegy 50 pg ptBM-1 plazmid DNS-t emésztettünk Avall-vel, és egy 747 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélről. Két komplementer 27 illetve 30 bázispár hosszúságú DNS fragmenst, szintetizáltunk foszfotriészter módszerrel. Amint a 7. ábrából látható, ez a DNS kapcsoló a Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp hexapeptidet kódolja, és szintén helyreállítja a hiányzó 92-94. aminosavakat (Cys-Tyr-Glu) az Avall-vel hasított 747 bp-s DNS-ben. Csak az alsó oligomer (30-mer) van foszforilezve 5’ végénél. Mintegy 1 pg 747 bp-s DNS-t és 1 pg oligomer kapcsolót ligáltunk egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a' DNS-t 2 órán át emésztettük EcoRI-vel, igy egy 354 bp-s DNS fragmenst nyertünk 1,4%-os agaróz gélről. A három fenti 12 DNS fragmens, 394 bp, 246 bp (UK horog) és 354 bp, mindegyikéből mintegy 500 ng-ot ligáltunk egy éjszakán át, T4 DNS ligázt alkalmazva. Fenolos extrahélás és etanolos kicsapás után a DNS-t EcoRI-vel emésztettük, és egy 994 bp-s DNS fragmenst izoláltunk és tisztítottunk 1% agaróz gélről. Ezt a DNS-t, ekvimoláris mennyiségű, EcoRI-vel hasított pUC 13 vektorral végzett ligálás után alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. 12 rekombináns klónból készült mini-plazmid DNS készítményt emésztettünk EcoRI-vel. Egy kiónt, amely tartalmazza a kivént .994 bp-s beiktatást, 1 liter LB tápközegben növesztettünk a plazmid DNS nagy léptékű előállításéhoz. Mintegy 10 pg ilyen plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel és Narl-el, és egy 700 bp méretnek megfelelő DNS fragmenst tisztítottunk az 1%-os agaróz gélből. A t-PA gén 3’ végét úgy nyertük, hogy mintegy 10 pg ptPMM-1 plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel és Narl-el. A reakciókeverék szeparálása után 1%-os agaróz gélen, egy mintegy 1300 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval, és tisztítottunk. A két DNS fragmens (700 bp és 1300 bp méretű) mintegy ekvimoláris mennyiségét ligáltuk egy éjszakán át, és egy 2000 bp-s DNS fragmenst nyertünk ki 1%-os agaróz gélből. Ezt a BamHI restrikciós enzim szekvencia által szegélyezett DNS-t beiktattuk a BPV kifejeződő vektor BglII helyére. Ez a DNS egy olyan fehérjét kódol, amely összesen 650 aminosavat tartalmaz - 35 aminosavat a szignál pepiidhez és 615 aminosavat az érett fehérjéhez. A hagyományos tenyésztési, kinyerési, izolélési és tisztítási technikák az 1(b) ábra szerinti hármas-horog plazminogén aktivétort eredményezik. 3. példa 261-(Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp-UKaa?°-m)-262-t-PA Ebben a példában az urokináz horog szekvenciát éppen a t-PA gén kettős horog területe után iktatjuk be, vagyis a 261. aminosavnak (Cys) és 262. aminosavnak (Ser) megfelelő szekvenciák közé. A 8. ábra mutatja be a különböző, ennek a hármas-horog PA-nak termelésében érdekelt lépéseket részletező vázlatot. Mintegy 10 pg pWP42 plazmid DNS-t emésztettünk Hgal-el és egy 400 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélről. Ez a DNS fragmens tartalmazza a t-PA horog-területe egy részének, azaz a 135-261-aminosavnak megfelelő szekvenciát. Meg kell jegyezni, hogy a t-PA kettős területe a 92. aminosavtól a 261-ig terjed, a két hurok között egy hexapeptid összekötéssel (174-179. aminosavak). Foszfotriészter módszerrel szin-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
