200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
15 HU 200795 B 16 alatt. A két komplementer nukleotid szekvencia így kialakított duplexét (kb. 1 pg) ligái— tűk mintegy 300 ng 242 bp-s DNS fragmenshez ligáz pufferban 4 °C hőmérsékleten 16 órán ét, 400 egység T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligáit keveréket 1,2%-os agaróz gélen végzett elektroforézissel szeparáltuk, és egy mintegy 320 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval. Ezt a fragmenst (mintegy 20 ng) ligáltuk 100 ng, Sall-elhasitott pUC 13-hoz, és az így nyert vektort alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. A sejteket ampicillines X-gal lemezekre szélesztettük. 12 fehér telepet különítettünk el és növesztettünk, hogy mini-plazmid készítményt állíthassunk elő. A mini-plazmid készítményt Sall-el hasítottuk. Egy kiónt, amely a vért 320 bp-s DNS beiktatást tartalmazta, növesztettünk plazmid DNS nagy léptékű előállításához. A DNS-t Saíl-el és Ncol-el hasítottuk, így 260 bp-s DNS fragmenst termelve preparatív agaróz gél elektroforézis után. A 260 bp-s DNS és 1200 bp-s DNS fragmenseket, amelyek egy közös Ncol restrikciós helyet tartalmaztak a gén 333 bp helyzeténél, ekvimoláris mennyiségben összekevertük ligáláshoz. A ligáit terméket Sall-el hasítottuk és a reakciókeveréket 1%-os preparatív agaróz gél elektroforézissel szeparáltuk, Egy 1460. bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval. Ezt a DNS-t Sall-el hasított pUC 13-hoz ligáltuk, és az így nyert plazmidot alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására; a transzformáló keveréket ampicillint és X-galt tartalmazó lemezekre szélesztettük. 12 fehér telepet választottunk ki és növesztettünk, hogy mini-plazmid készítményt állitsunk elő, az előállítást forralásos módszerrel végezve. A mini-plazmid készítményt Sall-el hasítottuk, és egy klónról (pUKBM) úgy találtuk, hogy tartalmazza a kívánt 1460 bp-s DNS beiktatást. A pUKBM-et nagy térfogatban növesztettük, hogy plazmid DNS-t kapjunk. A szintetikus kapcsolót tartalmazó 5’ végből származó oligonukleotid-szekvenciát szekvencia-elemzésnek vetettük alá Maxam és Gilbert módszere szerint, hogy bebizonyítsuk ennek valódiságát. A pUKBM plazmid ban levő DNS beiktatásról ezáltal megállapítottuk, hogy tartalmazza az AUG iniciációs kodont (met, -20 aminosav a vezető szekvenciában), valamint a TGA befejező kodont. Ez a komplett gén kódolja a szignói peptid 20 aminosavát (-1-től -20-ig) és az érett urokináz fehérje 411 aminosavát. 1. példa (UKaa-P-^-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)1-31^-PA Az 1(a) ábrán bemutatott vegyületben a szignál peptid (a.a. -35-től -1-ig) és az N-terminális peptid-(a.a. 1-91 (-területeket tartalmazó t-PA szekvenciát helyettesítettük egy olyan aminosav szekvenciával, amely az urokináz szignál peptidjét <a.a. -20-tól -1-ig) és az első 131 aminosavát tartalmazta. Az u-PA szekvencia a t-PA első horgához (tPKl) egy olyan oligonukleotid szekvencián keresztül kapcsolódik, amely az L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp hexapeptidet kódolja. Mintegy 10 pg pUKBM plazmidot emésztettünk EcoRI-vel és Mstl-el standard körülmények között. A reakciókeveréket elektroforézisnek vetettük alá 1,2%-os agaróz gélen, 150 Voltnál 3 órán át. A gél etidium-bromiddal végzett festése után - hogy láthatóvá tegyük a DNS csíkokat -, egy 452 bp-s DNS fragmenst izoláltunk és tisztítottunk. Ez a DNS fragmens kódoló információkat tartalmaz a vezető vagy szignál peptidre (20 aminosav), valamint az urokináz gén N-terminális és horog területére (a.a 1-131) vonatkozóan. Abból a célból, hogy a t-PA-dez-a.a, 1-91 szekvenciát nyerjük, mintegy 10 pg ptPBM-1 rekombináns plazmidot emésztettünk teljességig Avail-vei, és ■ elektroforézisnek vetettük alá 1,2%-os agaróz gélen, hogy izoláljuk egy 747 bp-s DNS fragmenst. Egy oligomer kapcsoló hozzáadását ehhez a fragmenshez, majd az ezt követő emésztést EcoRI-vel, hogy egy 354 bp-s DNS fragmenst nyerjünk, a 2. példában írjuk le, és a 7. ábrán ábrázoljuk. A 354 bp-s DNS a hexapeptid kapcsolót és a t-PA peptidet (a.a. 92- -204) kódolja, vagyis egy 118 aminosavból álló szekvenciát. Az előző fejezetben előállított 452 bp-s DNS fragmens és a fenti 354 bp-s DNS fragmens ekvimoláris mennyiségeit ligáltuk, T4 DNS ligázt alkalmazva 15 °C hőmérsékleten 16 órán át. A reakciókeveréket elektroforézissel szeparáltuk 1,2%-os agaróz gélen, és egy DNS csíkot, amely 806 bp méretnek felel meg, eluáltunk és tisztítottunk. Mintegy 100 ng 806 bp-s DNS fragmenst ]igáltunk mintegy 300 ng, BAP-pal (bakteriális alkalikus foszfatáz) kezelt EcoRI pUC 13-al (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, Wisconsin) mintegy 20 pl reakciótérfogatban. Az oldat mintegy 1/4-ét alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 törzsek transzformálására Viera J. és Messing J. eljárása szerint [Gene, 19, 259(1982)]. 12 rekombináns fehér telepből készített mini-plazmid DNS-t hasítottunk EcoRI-vel standard körülmények között. Egy kiónt, a ptPUK-806-ot, amely a kívánt beiktatást tartalmazta, emésztettük BamHI-vel és Narl-el, és az Így nyert terméket elektroforézissel szeparáltuk 1,2%-os agaróz gélen. Egy 519 bp-s fragmensnek megfelelő DNS 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
