200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
21 HU 200795 B 22 tetizáltunk egy oligonukleotid kapcsolót, amely két DNS szekvenciát - 24-mer és 21- -mer - tartalmaz, amint ezt a 8. ábrán bemutatjuk. Ez az oligomer kapcsoló kódolja a hexapeptid kapcsolót, valamint az UK horog hiányzó 50. (Cys) aminosavát, és Hgal és Ndel restrikciós enzim szekvenciákkal van szegélyezve. Csak a felső oligonukleotid, a 23-mer van foszforilezve 5’ végénél. Ezt ligáltuk a t-PA-ból származó 400 bp-s DNS fragmens Hgal végéhez. A 421 bp-s DNS terméket izoláltuk 1%-os agaróz gélen. A t-PA horog utáni részét olyan módon nyertük, hogy 10 /ug pWP 42 plazmid DNS-t Rsal-el emésztettünk, ezt követően egy 501 bp-s DNS-t izoláltunk 1,2%-os agaróz gélen. Ez a DNS képviseli a t-PA molekula 269- -435. aminosavait. Két komplementer, 22 bázis hosszúságú oligonukleotid szekvenciát, amelyek a 8. ábrán láthatók, szintetizáltunk a foszfotriészter módszerrel. Ez a DNS kapcsoló, amikor 5’ végénél az 501 bp-s DNS-hez ligáljuk, helyreállítja a 262-268. hely közötti hiányzó aminosavakat. Mintegy 1 /ug 5Ó1 bp-s DNS-t és 1 /ug kapcsoló DNS-t ligáltunk egy éjszakán át, és egy 523 bp méretnek megfelelő DNS csíkot tisztítottunk 1%-os agaróz gélről. A három 421 bp, 246 bp (UK horog) és 523 bp méi'etű DNS fragmenst, ligáltuk mintegy ekvímoláris mennyiségben 15 °C hőmérsékleten 16 órán át. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t EcoRI-vel elhasitottuk, és egy 741 bp-s DNS fragmenst izoláltunk. Ezt a DNS-t, amely- két EcoRI restrikciós hellyel van szegélyezve, sokszorozzuk pUC 13 vektor-rendszerben, amint ezt fentebb leírtuk. 10 /ug ptPBM-1 plazmid DNS-t, amelyben az EcoRI helyet a többszörös klónozó helyen eltávolitottuk, emésztettünk teljes mértékben EcoRI-vel, és a mintegy 4,0 Kb méretű nagyobb vektor DNS fragmenst izoláltuk 1%-os agaróz gélről. EcoRI-vel hasított vektor DNS-t és a 741 bp-s DNS-t ligáltuk mintegy ekviraoláris mennyiségben, és az így létrejött terméket használtuk kompatens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. 12 rekombináns klónból készített mini-plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel, hogy megkeressük a mintegy 1,8 Kb méretű kívánt beiktatást. A 741 bp-s DNS korrekt orientációját a beiktatásban olyan módon határoztuk meg, hogy a plazmid DNS-t Narl-el és Mstl-el emésztjük. Egy klónról, a ptPUHYC-röl, amikor Narl-el és Mstl-el emésztjük, úgy találtuk, hogy tartalmaz egy mintegy 700 bp-s fragmenst korrekt orientációban. A ptPUHYC plazmid DNS BamHI-vel végzett emésztésével nyert 1,8 Kb méretű DNS tartalmazza a 650 aminosavból álló fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát - a fehérjéből 35 aminosav felel meg a szignál peptidnek és 615 aminosav az 1(c) ábra termékének megfelelő érett fehérjének. A hármas-horog gént azután BglII-vel hasított szarvasmarha papilloma vírushoz (BPV) ligáltuk, amely komplett kifejeződő vektorként szolgált. A hagyományos tenyésztéssel az 1(c) ábra szerinti hármas-horgot tartalmazó plazminogén aktivótort lehet termelni. NÉGYES-HORGOT TARTALMAZÓ PLAZMINOGÉN AKTIVATOR Protrombin cDNS A protrombin génhez szolgáló cDNS kiónt izoláltunk emberi máj cDNS könyvtárból, Friezner és munkatársai módszerét követve [Biochemistry, 22, 2087 (1983)]. A pPTR klón tartalmazza az 579 aminosavból álló érett fehérjéhez szolgáló teljes kódoló információt. A protrombin kettős horog területe a 65. aminosavtól (319. bp) a 248. aminosavig (840. pb) terjed, vagyis egy 248 aminosavból álló peptid. A két horog, a PTK1 (65-143. aminosavak) és PTK2 (170-248 aminosavak) mindegyike 79 aminosav hosszúságú, és egy 26 aminosav hosszúságú pepiiden (144-169. aminosavak) ót kapcsolódnak. A protrombin kettős horog szekvencia előállítása A kettős horog területet képviselő DNS szekvenciát a protrombin cDNS-ból két lépésben izoláltuk (12. ábra). Az 1. lépésben 10 /ug pPTR plazmid DNS-t emésztettünk Aval-el, és egy 706 bp-s DNS-t izoláltunk 1%-os agaróz gélről. Ezt a DNS-t kezeltük Bal 31-el 7,5 másodpercen át, hogy eltávolitsunk mintegy 38 bp-t a DNS mindegyik végéről [Legerski és munkatársai: Nucleic Acid Res. 5, 145 (1978)]. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapós utón a DNS-t GGAATTCC EcoRI kapcsolóhoz ligáltuk 4 °C hőmérsékleten 15 órán át. Ez a kapcsoló, amikor a CTGAG vagy TGAG (67. aminosav, Glu) szekvenciával végződő DNS-hez ligáljuk, egy új restrikciós szekvenciát hoz létre MstlI-höz (CCTGAGG) a kettős horog N-terminálisánál (67. aminosav). EcoRI-vel végzett hasítás után egy 630 bp méretű DNS fragmenst izoláltunk. Ezt a DNS-t, miután ekvimoláris mennyiségű EcoRI/pUC13-al ligáltuk, alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. A kívánt kiónra való kezdeti átvizsgálást in situ hibridizálással hajtottuk végre egy 32P jelzett GAATTCCTGAGGGTCTG vizsgáló mintával, amely tartalmazza a 66-68. aminosavnak megfelelő nukleotid szekvenciákat. 12 kiónt, amely erős jelet mutatott röntgenfilmen, növesztettünk, hogy mini-plazmid készítményt állítsunk elő. A plazmid DNS MstlI-vel és BamHI-vel végzett emésztése után egy klónról, a pPTK-5’-röl azt találtuk, hogy tartalmazza a mintegy 630 bp-s 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
