200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
23 HU 200795 B 24 kívánt beiktatást, valamint az újonnan megalkotott MstlI helyet is 322 bp-nél. A második lépés magéban foglalja a horog-terület 3* végének összeszerkesztését a 248. aminosav körül, hasonló megközelítést alkalmazva, mint ahogyan fentebb leírtuk. Mintegy 10 pg pPTK-5’ plazmid DNS-t emésztettünk teljes mértékben BamHI-vel. A DNS-t azután Bal 31-el 15 másodpercen át kezeltük 30 °C hőmérsékleten, hogy eltávolitsunk mintegy 82 bp-t a DNS mindkét végéről. Fenolos extrahálés és etanolos kicsapás után a DNS-t a CGCAGAATTCTGCG EcoRI/FspI kapcsolóhoz ligáltuk. Amint ezt neve is jelzi, a kapcsoló egy Fsp I szekvenciát (TGCGCA) alakit ki bármely olyan DNS szekvenciánál, amely TG-ben végződik. Miután EcoRI-vel alaposan elhasitottuk, egy 546 bp-s DNS-t izoláltunk 1,2%-os agaróz gélről, majd ezt ligáltuk EcoRI-vel hasított pUC 13-hoz. Az igy nyert rekombináns plazmidot alkalmaztuk azután kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. Mintegy 1000 rekombináns kiónt vizsgáltunk át in situ, 32P-vel jelzett CTCAACTATTGCGCAGAA szekvenciájú oligomerrel (245-248. amiosavak). 12 potenciális kiónból készített plazmid DNS-t hasítottunk MstlI-vel és Fspl-el, és az igy nyert terméket 1%-os agaróz gélen futtattuk. Egy klónról, a pPT2K-ról, úgy találtuk, hogy tartalmazza a kívánt, 546 bp méretű beiktatást. Ez a DNS kódolja a teljes 182 aminosavat, a kettős-horog terület 67-248. aminosavait. A fennmaradó két aminosavhoz [a 65. helyzetnél (Cys) és a 66. helyzetnél (Alá)] tartozó nukleotid szekvenciát egy oligomer kapcsolón keresztül adtuk hozzá, amint ezt a 13. ábrán bemutatjuk. 4. példa 91 (PTKtitPs~2is-Ser-Ghj-Gly-Asn-Ser-Asp)-92- -t-PA A protrombin kettős-horog szekvenciáját (a 65-248. aminosavakat) beiktattuk a t-PA kettős-horog területe elé (vagyis a 91-92. aminosavak közé), hogy létrehozzuk a négyes-horgot tartalmazó PA-t. Amint az előző példában leírtuk, a pPT2K plazmid DNS MstlI + Fspl vagy EcoRI emésztése egy 546 bp-s DNS fragmenst hoz létre, amely a protrombin 67-248. aminosavait kódolja. A két oligonukleotid kapcsoló alkalmazása révén az 546 bp-s DNS két végét beiktatjuk- a t-PA génbe a 462. nukleotid (91. aminosav) és 463. nukleotid (92. aminosav) közé. A követett eljárás vázlatát a 13. ábrában mutatjuk be. A 354 bp-s DNS-t, amely a Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp peptidkapcsolóhoz, valamint a t-PA 92-204. aminosavaihoz tartozó nukleotid szekvenciát tartalmazza, olyan módon készítettük el, ahogyan azt a 2. példában leírtuk és a 7. ábrában bemutattuk. A 354 bp-s DNS 14 és az 546 bp-s DNS (protrombin horgok) ekvimolóris mennyiségét ligáltuk 4 °C hőmérsékleten 16 ólán át. A DNS-t EcoRI-vel hasítottuk, és egy 900 bp-s DNS fragmenst izoláltunk agaróz gélről. Ezt a DNS-t EcoRI-vel hasított pUK 13 vektorhoz ligáltuk, az így nyert terméket alkalmaztuk E. coli JM 103 sejtek transzformálására. 12 rekombináns klónból nyert mini-plazmid készítményt emésztünk EcoRI-vel és MstlI-vel. Egy klónról, a pPT2KTPK-ról úgy találtuk, hogy tartalmazza a kivént 900 bp-s beiktatást. Ez a DNS kódolja a teljes 300 aminosavat, 182 aminosavat a protrombinhoz (67-248. aminosavak), egy hexapeptidet, és 112 aminosavat a t-PA-hoz (92-204. aminosavak). A ptPBM-1 plazmid EcoRI-vel és Asul-el végzett emésztése révén nyert 385 bp-s DNS előállítását a 7. ábrán írjuk le. Két komplementer, egyaránt 12 bp-s oligonukleotid szekvenciát szintetizáltunk foszfotriészter módszerrel. Ez a kapcsoló helyreállítja a protrombin horog terület hiányzó aminosavait (Cys és Alá), és ez Asul és MstlI felismerő szekvenciákkal van szegélyezve. Mintegy 500 ng DNS-t (385 bs-s) ligáltunk 1 pg foszforilezett kapcsolóval, amint ezt a 13. ábrán bemutatjuk. EcoRI-vel végzett hasítás után egy 402 bs-DNS fragmenst izoláltunk. Mintegy ekvimoláris mennyiségű 402 bp-s DNS-t és 900 bp-s DNS-t ligáltunk, az igy nyert terméket EcoRI-vel hasítottuk • és egy 1302 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélről. Ezt a DNS-t szubklónoztuk EcoRI-vel hasított pUC 13 vektorban. 12 rekombináns kiónból izolált plazmid DNS-t emésztettünk EcoRI-vel. Egy kiónt, a pNPT2- KPAK-t, amely a kívánt beiktatást tartalmazta, növesztettünk plazmid DNS nagy léptékű előállításához. A plazmid DNS-t emésztettük teljességig BamHI-vel, majd részlegesen Narl-el, igy kapva egy 986 bp-s DNS fragmenst. Hasonló módon kaptunk egy 1300 bp-s DNS fragmenst ptPBM emésztésével BamHI-vel és Narl-el. A két DNS fragmenst, a 986 bp és az 13000 bp méretűt, ekvimoláris mennyiségben ligáltuk, az igy nyert terméket BamHI-vel hasítottuk, és egy 2286 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélen végzett elektroforézis után. A BamHI szekvenciákkal szegélyezett DNS-t beiktattuk *a BPV kifejeződő vektorba BglII helyénél. Ez a DNS kódolja a teljes 752 aminosavat - 35 aminosavat á szignál peptidból és 717 aminosavat az érett fehérjéből. Az érett fehérje mintegy 92000 becsült molekulatömeggel 184 aminosavat tartalmaz a protrombin kettős-horog területéből, valamint tartalmaz egy hexaheptid kapcsolót és a teljes t-PA szekvencia 527 aminosavat. A hibrid plazminogén aktivá torok kifejeződése és biokémiai jellemzése Az 1(a) és 1(b) ábrában bemutatott két hibrid plazminogén aktivétort előállítottuk a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
