200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
11 HU 200794 B 12 kereten belüli kifejeződését. Egy más módszer szerint a beiktatott DNS-t tartalmazó plazmidot egy egyedi restrikciós helynél nyithatjuk ki a bakteriális és a beiktatott DNS között és a DNS-t röviden kezeljük Bal 31 enzimmel, hogy eltávolitsunk néhány bázist a linearizált DNS mindkét végéről. A helyreállítás után a DNS polimeráz 1 nagy (Klenow) fragmensével, a plazmidot újra kór alakúvá formáljuk T4 ligázzal és felhasználjuk baktériumok transzformálására. A három transzformáns közül egy tartalmazta a P.195 szekvenciát a helyes leolvasó keretben, a trpE géntermékkel egyesített fehérje formájában kifejezve. Akik a szakterületen jártasak, méltányolni tudják, hogy a Bal 31-gyel végzett emésztés mértéke szabja meg a kifejezett fúziós fehérje végső méreteit és a benne levő trpE és P.195 szekvencia relatív hosszát. Ezen túl a szintetikus kapcsoló (linker) beiktatása a Bal 31 emésztés és helyreállítás utáni ligálás során megkönnyiti a szóban forgó törzsek elemzését, transzformálás után. A megfelelő restrikciós enzimes emésztés és Bal 31 enzimes kezelés értelmes alkalmazásával a P.195 bármelyik fajlagos területét ki lehet fejezni fúziós fehérjeként. így a találmány egy másik kiviteli formája olyan vektort szolgáltat, amely találmány szerint DNS szekvenciát tartalmaz egymás utáni helyzetben kapcsolva egy ideillő gazdaszervezetbe átvihető gén amino-terminális kódoló - területéhez, és adott esetben ehhez társuló bármilyen kontroll szekvenciádhoz, amely, amikor egy megfelelő gazdaszervezet transzformálásához használjuk, egy olyan fúziós fehérje termelését eredményezheti, amely a P.195 legalább egy részét tartalmazza, vagy egy olyan peptid termelését, amely a P.195 legalább egy epitopját tartalmazza. Egy másik módszer a DNS fragmensek kifejeződéséhez egy nyitott leolvasó keret (ORF) vektor alkalmazása, amelybe általában DNS rövid darabjai vannak beiktatva, gyakran egy E. coli fehérje N-terminális aminosav-szekvenciáját kódoló szekvencián belül. A beiktatott DNS-nek nem szabad stop kodonokat tartalmaznia az átirás irányára vonatkoztatott helyes orientációban, és korrekt keretben kell lennie mindkét végnél. Egy véletlenszerű hasítási módszerrel kialakított fehérje-kódoló szekvenciából nyert DNS darabokhoz a leolvasás elvi valószinűsége a korrekt keretben 1:18. #-galaktozidázon alapuló ORF vektorokat Írtak le (Koenen és munkatársai, 1982). Egy DNS darab beiktatása egy helyre a fehérje N-terminálisánál a korrekt keretben a 0-galaktozidáz fehérje kiolvasó kifejeződését adja át, amelyet az 5- -bróm-4-klór-3-indolil-/5-D-galaktozid (Xgal) kromogén szubsztrátum hidrolízisével mutathatunk ki. így pl. ha X-gal van az agarban, amelyen a telepek nőnek, egy megfelelő gazdatörzs transzformációja egy funkcionális ß-8-galaktozidázt kifejező plazmiddal kék telepeket eredményez. Egy ilyen vektor, a pXY460, a 0-galaktozidáz gént a tac promoter szabályozása alatt tartalmazza. A DNS beiktatása az Smal helyre az EcoRl helyet követően átalakíthatja a gént kereten belüli kifejeződésre. Az E. coli gazdaszervezet, pl. a JM105 transzformálása átalakítja a baktériumot ampicillin-rezisztenssé és a fúziós fehérje kifejeződését magas szinten lehet indukálni izopropil-0-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával. Így a találmány egy másik szempontja szerint egy olyan vektort szolgáltatunk, amely egy megfelelő gazdaszervezetben átfordításra (transzlációra) képes, kívánt esetben a megfelelő szabályozó szekvenciákkal ellátott gént tartalmaz, amelybe a találmány szerinti DNS szekvencia be van iktatva megfelelően átalakított formában úgy, hogy az említett gén karboxi-terminálisnak a része az említett DNS szekvenciához korrektül fordítódik át kifejeződésre egy megfelelő gazdaszervezetben, Így egy fúziós fehérjét termelve, amely legalább egy részét tartalmazza a P.195-nek vagy egy peptidet termelve, amely a P. 195-nek legalább egy epitopját és az említett génnel kódolt fehérje egy részét tartalmazza. A P.195 gén részével kódolt peptidet a fúziós fehérjében le lehet hasítani a fúziós fehérjéről a megfelelő peptidkötés enzimes vagy kémiai hasításával. Azok számára, akik a szakterületen jártasak, a kifejezett aminoszekvencia vizsgálatával nyilvánvaló, milyen enzimes vagy kémiai hasítási módszert lehet alkalmazni. Egy szintetikus oligonukleotid kapcsoló (linker) beiktatásával a P.195 DNS szekvencia és a bakteriális génszekvencia közé a fúziós fehérjét kifejező rendszerben egy megfelelő helyet lehet szolgáltatni az enzimes vagy kémiai hasításhoz a P.195 szekvencia és a kifejezett fúziós fehérje többi része között. Ilyen módon a P.195 génnel kódolt fragmenseket meg lehet tisztítani a gazdaszervezet-peptidek tói. A P.195 fehérjéhez vagy részeihez tartozó kódoló szekvenciák közvetlen kifejeződését el lehet érni a beiktatott DNS szekvencia elhelyezésével közvetlenül egy AUG start kodon után a helyes leolvasó keretben úgy, hogy a DNS beiktatás helyettesíti ~a bakteriális szabályozó terület által normálisán átírt és átfordított kódoló szekvenciát. Egy ilyen szabályozó terület magában foglal egy promotort és egy riboszóma kötőhelyet a start kodonhoz viszonyítva optimális helyzetben. A kifejezendő DNS szekvenciát korrektül el lehet helyezni megfelelő restrikciós helyek alkalmazásával, és ha szükséges, egy megfelelő szintetikus oligonukleotid linker alkalmazásával. A beiktatott DNS szekvencia végénél egy stop kodont lehet beiktatni a megfelelő leolvasó keretben az átfordítás (transzláció) megállítására és egy terminátor 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
