200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
9 HU 200794 B 10 sze. A P.195 83 000 molekulatömegű fragmensének 20 amino-terminális maradékainak szekvencia-elemzése kimutatja, hogy a megfelelő kódoló szekvencia az 1. ábrában a 273- —tói 332-ig található helyen helyezkedik el, Így lehet behatárolni ezt a fragmenst a génen belül. A 42 000 molekulatömegű fragmens elhelyezkedését monoklonális antitestek alkalmazásával határozzuk meg hagyományos módon, amint ezt a 7. példában leírjuk. Megállapítható, hogy a 42 000 molekulatömegű fragmenst és a 83 000 molekulatömegű fragmenst kódoló szekvenciák a gén ellenkező végein vannak. A P.195 génben levő alléi változatok kimutatására szolgáló kísérletek azt mutatják, hogy a legnagyobb megőrzés az 5' területben a Hind III helynél (a 83 000 molekulatómegű fragmensben) és a 3’ nem-kódoló területben fordul elő (2. ábra). A legnagyobb mértékben megőrzött szekvencia a gén 3' végénél van, amely a 42 000 molekulatömegű fragmens karboxi-terminálisánál levő mintegy 130 aminosavból álló maradéknak felel meg, azt sugallva, hogy ez a fragmens legalább egy hasznos epitopot tartalmaz. így a találmány egy további megtestesülése szerint a P.195 42 000 molekulatömegű fragmensének megfelelő DNS szekvenciát szolgáltatunk. A találmány szerinti DNS szekvenciát lehet alkalmazni a DNS szekvenciát tartalmazó vírusok előállítására, igy pl. egy (Tk*) Vaccinia virus törzset, amely nem képes átvinni a fertőzött törzsre a hipoxantint nem tartalmazó tápközegen való növekedés képességét, alkalmazunk egy szövettenyészet fertőzésére. A szövettenyészetet azután a P.195 génnel vagy annak fragmensé(i)vel transzformáljuk, és egy Tk4 genetikai determinánshoz kapcsoljuk. Az ezt kővető virus utódokból néhány rendelkezni fog ilyen transzformáló szekvenciákkal a genomjain belül levő beiktatások formájában. Ezeket azután ki lehet választani olyan képességük alapján, hogy átadják a szövettenyészet sejtjeinek azt a képességet, hogy hipoxantin-mentes tápközegen nőjenek. Az olyan telepeket, amelyek kinőnek, tovább szelektáljuk P.195 termelésre, vagy olyan peptidek termelésére, amelyek ennek legalább egy epitopját tartalmazzák, pl. egy megfelelő monoklonális antitest, mint az Fill.2, alkalmazásával. Az ilyen Vaccinia törzseket lehet azután alkalmazni maláriára fogékony állatok megfertőzésére, mint olyan új Vaccinia törzset, amely egy immunogén malária-peptid vagy peptidek termelését váltja ki. igy a találmány egy még további szempontja szerint egy nem patogén virust szolgáltatunk, amely a találmány szerinti DNS szekvenciával rendelkezik, és amelyet fel lehet használni malária elleni immunitás előidézésére fogékony gerinces gazdaszervezetekben. Fel kell tételezni, hogy az ilyen vakcinák könnyen képesek immunitást nyújtani más fertőzések ellen is, pl. himlő, diftéria, hepatitisz B, veszettség, Herpes simplex vírusfertőzés, szamárköhögés, stb. ellen, igy a találmány olyan, a fentiekben definiált nem patogén virust szolgáltat, amely továbbá képes immunitást nyújtani más fertőzések ellen is, és amelyet be lehet vezetni bármilyen más vakcinával együtt, vagy egyedül is. A P. 195-höz szolgáló DNS szekvencia fentebb leirt jellemzésére alapozva a szekvencia bármely kívánt fragmensének klónozása lehetséges az igy összeállított restrikciós térképre utalva. Idegen DNS-darab beiktatása egy E.coli génbe a helyes leolvasó keretben lehetővé teszi egy összekapcsolt (fúziós) fehérje kifejeződését, amely fehérjében az aminosav szekvencia egy része az E. coli génből származik, és egy másik része a beiktatott DNS-ból származik. Megfelelő kifejeződő vektorokat megfelelő szabályozó szekvenciákkal és kellemes restrikciós helyekkel alkotunk meg, amelyek lehetővé teszik az összekapcsolt fehérjék kifejeződésének magas szintjét. így a kiválasztott kifejeződő rendszer restrikciós térképének és a kifejezendő szekvenciának a vizsgálata az átfordító keret ismeretével együtt lehetővé teszi a fajlagos DNS fagmensek bekapcsolását (ligálását) a kifejeződő vektorba, valamint ennek kifejeződését további manipuláció nélkül, igy pl. a pWRL 507 egy pAT153-ból és trpE génből megalkotott plazmid (Nichols, B.P. és munkatársai: J, Mól. Bioi. 146, 45-64, /1981/) szintetikus EcoRI-BglII kapcsolószakasszal (linkerrel), amely a BglII helynél, a 1223 nukleotidnál van beiktatva a trpE génbe (4. ábra). Ezt a vektort el lehet hasítani Ndel-el és EcoRI-vel, EcoRI-vel és BamHI-vel, vagy EcoRI-vel és HindIII-al, és a kis DNS fragmenst (vagy fragmenseket) helyettesíteni a pPFgl 2,7Kbp-s Ndel-EcoRI fragmensével illetve a pPFcl028 400 bp-s EcoRI-BamHI fragmensével illetve a pPFcl028 2,4 Kbp-s EcoRI-HindlII fragmensével (ahol a Hindin hely a plazmid polimer kapcsolószakaszában /polilinkerjében/ van). Ezen kivül fajlagos fragmenseket, mint pl. a pPFcl028 1,2 Kbp-s EcoRI-Ndel fragmensét szubklónozni lehet a pUC9 polilinker területébe (ebben a példában mint egy EcoRI (tompavégű fragmenst), majd EcoRI-val és HindIII-al kivágni és EcoRI-vel és HindIII-al hasított pWRL 507-be klónozni. A megfelelő restrikciós enzim-helyeket alkalmazva a P.195 génszekvenciából származó DNS fragmenseket klónozni lehet à trpE génen belül a helyes orientációban, de általában a rossz átforditási keretben. Abból a célból, hogy a beiktatott szekvencia kifejeződését nyerjük, megfelelő hosszúságú szintetikus kapcsolót (linkért) iktatunk be a trpE gén és a beiktatott szakasz közti restrikciós helybe, igy adva meg az egyesitett fehérje 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
