200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
1 HU 200794 B A találmány tárgya Plasmodium falciparum DNS-ének és fragmenseinek klónozott szekvenciája, amelyet arra lehet felhasználni, hogy antigén peptideket szolgáltasson malária vakcinákhoz. 5 A malária növekvő egészségügyi probléma az egész harmadik világban. Több száz millió ember szenved ettől a betegségtől, és ennek legakutabb formájától, amelyet a Plasmodium falciparum protozoa parazita okoz; ez 10 több, mint egy millió gyermeket öl meg minden évben egyedül csak Afrikában. Hatásos immunitás a parazita aszexuális sokszorozódása ellen megakadályozná a klinikai betegséget. A vörösvérsejtek új inváziójának meg- 15 előzése egy hatásos immun-válasszal az inváziós forrná, a merozita ellen megszakíthatná ezt a ciklust. Egy rágcsáló malária modellben kimutatták, hogy az érett eritrocita-kózti formán, a 20 schizontán belül szintetizált és a merozoita felületén kifejezett fehérje antigént tisztítani lehet, és hogy ez az antigén védő immunitást alakíthat ki Plasmodium yoelii ellen (Holder, A.A és Freeman, R.R.: Nature, 294, 361-364 25 /1981/). Ennek az antigénnek a látszólagos molekulasúlya (MS) 230 000 és ez proteolitikus folyamatnak van alávetve in vivo úgy, hogy az antigén elkülönített fragmensei vannak jelen a merozoita felületén (Holder és 30 Freeman, 1981, fentebb idézett munka; Holder, A.A. és Freeman, R.R.: Parasitology 88, 211-219 /1984 a/). A .molekulatömeg* a látszólagos relatív molekulatömeget jelenti, amelyet poliakrilamid 35 gél elektroforézissel határoznak meg nátrium-dodecil szulfát és standard molekulatömegű jelző anyagok jelenlétében. A találmány szerinti antigén fehéi'jék molekulatömegét igy a Laemmli, U.K. által leirt (Nature, 227, 680- 40 -685 /1970/) technikával hagyományos módon határozhatjuk meg. A hagyományos standard molekulatömegü jelző anyagok lehetnek pl. a spektrin heterodimer (2,2 • 10s MS), Æ-galaktozidáz (1,16 • 104 MS), trióz foszfát, izomeráz 45 (2,7 • 104 MS) és lizozim (1,5 ■ 104 MS), 6 foszforiláz (9,3 • 104 MS), szarvasmarha szérum albumin (6,8 • 104 MS), aldoláz (3,9 • 104 MS). Amikor a fehérjét arra használták, hogy 50 egereket vakcináljanak vele, a védelem- adjuvánstól függő volt, és úgy tűnt, hogy a védelmet egy sejt által közvetített kivitelező biokémiai út szolgáltatja (Freeman, R.R. és Holder, A.A.: Clin. Exp. Immunol. 54, 609-616 55 /1983 a/), bár a fehérje elleni monoklonális antitestről kimutatták, hogy passzív védelmet ad át egerekre (Majariam, W.R, és munkatársai: J. Immunoi. 132, 3131-3137 /1984/). Analóg fehérje antigéneket Írtak le más 60 Plasmodium fajoknál is. A P.yoelii tisztított 230 000 molekulatömegü antigénje ellen létrehozott polivalens antiszérum immun-fluoreszcenciával keresztreakcióba lépett a vizsgált más Plasmodium fajok vérstádiumában levő 65 formáival (Holder és Freeman, 1984 a, fentebb említett munka). Plasmodium chabaudiban az antigént Western foltképzéssel azonosították, mint 250 000 molekulatömegü anyagfajtát, amelyet szintén fel lehet dolgozni (Holder, A.A. és munkatársai: Mól. Biochem. Parazitol. 9, 191-196 /1983/). A 250 000 molekulatömegü P. chabaudi fehérjére fajlagos monoklonális antitestekről kimutatták, hogy passzív védelmet adnak át a P. chabaudi kihívása ellen egerekben (Boyle, D.B. és munkatársai: Infect. Immun. 38, 94-102 /1982/). Plasmodium knowlesi 230 000 molekulatömegű fehérjéje elleni monoklonális antitest agglutinálja a merozoitákat és ezáltal gátolja a vörösvérsejtek elözönlését parazitákkal (Epstein, N. és munkatársai: J. Immunoi. 127, 212- -217 /1981/), és a P. knowlesi ezt a fehérjéjét in vivo a merozoita felületen kifejezett fragmensek sorozatává képes feldolgozni (David, P.H. és munkatársai: Mól. Biochem, Párásítói. 11, 267-282 /1984/). A P. falciparumban a P. yoelii 230 000 molekulatömegü fehérje antigénje elleni polivalens antiszérum keresztreakcióba lép egy 193 000 molekulatömegű antigénnel (amelyet a továbbiakban P. 195 fehérjének fogunk nevezni) (Holder és munkatársai /1983/, fentebb idézett munka). Ennek az antigénnek, amely glikoproteinnek tűnik (Howard, R.J. és munkatársai: Mól. Biochem. Párásítói. 11, 349— -362 /1984/), a bioszintézise a parazita schizonta formáján belül megy végbe, és az eritrocitán belüli stádium végénél az antigén proteolitikusan dolgozódik fel elkülönített fragmensekké (Holder, A.A. és Freeman, R.R.: J. Exp. Med. 156, 1528-1538 /1982/; Hall, R. és munkatársai: Mól. Biochem. Párásítói. 11, 61-80 /1984 a/). A merozoiták (amelyek az eritrocitán belüli stádium végén bocsátódnak ki a szérumba) felületén a fehérje teljesen feldolgozódik három elkülönített P.195 fragmensre, amelyek 83 000; 42 000 és 19 000 molekulatömeggel vannak jelen. Ez a három fragmens alkotja a merozoiták fő felületi antigénjeit, és ezeket a humán immunszérum erősen felismeri /Freeman, R.R. és Holder, A.A.: J. Exp. Med. 158, 1647-1653 /1983 b/; Holder, A.A. és Freeman, R.R.: J. Exp.Med. 160, 624-629 /1984 b/). A .P.195* kifejezést olyan 1,8 • 105 és 2.3 • 105 közti molekulatömegü fehérjék elnevezésére használjuk, amelyek a Plasmodium falciparum eritrocita schizonta formájában helyezkednek el, és amelyek in vivo mintegy 8.3 • 104; 4,2 ■ 104 és 1,9 • 104 molekulatömegü elkülönített fragmensekre dolgozódnak fel, összekapcsolva a parazita merozoita formájának felületi membránjaival. A P. falciparumon belül a P.195 bizonyos szerkezeti poliformizmust mutathat, amelyet a fajlagos monoklonális antitestekhez való kötődés mértékével vagy a látszólagos molekulatömegükben való kis különbségekkel lehet kimutatni (McBride, J.S. és munkatársai: 2 3
