200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
9 HU 200793 B 10 DHl/pTF4, az Institute for Ferraentation-nál (Fermentációs Intézet), Osaka (IFO)-14299 letéti számon helyeztük el, és szintén elhelyeztük a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technolo- 5 gy, Ministry of International Trade and Industry-nál, Japan (FRI) (Nemzetközi Kereskedelmi és Ipari Minisztérium, Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség, Fermentációs Kutató Intézet) FERM BP-628 letéti számon j^q a Budapesti Szerződés szerint. A jelen leírásban és ábrákban a bázisok és az aminosavak, amikor rövidített formában jelezzük, a rövidítéseket az IUPACIUB Biokémiai Nomenklatura Bizottságának szabályai 15 szerint vagy az érintett szakterület gyakorlata szerint végeztük el. A példák erre az 1. táblázatban találhatók. Optikai izoméria esetén az említett aminosavak L-formában vannak, hacsak különlegesen másképpen nem je- 20 lezzük. 1. TÁBLÁZAT 25 DNS = dezoxiribonukleinsav cDNS = komplementer dezoxiribonukleinsav A = adenin T timin 30 G = guanin C = . citozin RNS . = ribonukleinsav mRNS = messenger (hírvivő) ribonukléinsav 35 dATP = dezoxiadenozin-trifoszfát dTTP = dezoxitimidin-trifoszfát dGTP = dezoxiguanozin-trifoszfát dCTP = dezoxicitidin-trifoszfát ATP = adenozin trifoszfát 40 EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav SDS = nátriu m-laur il- szulfát Gly •= glicin Alá = alanin . Val = valin 45 Leu = leucin Ile = izoleucin Ser 1 = szerin Thr = treonin Cys = cisztein 50 1/2 Cys = fél cisztein Met = metionin Glu = glutaminsav Asp = aszparaginsav Lys = lizin 55 Arg = arginin His = hisztidin Phe = fenil-alanin Tyr = tirozin Trp = triptofán ßo Pro prolin Asn = aszparagin Gin S glutamin 65 Az ábrák rövid leírása Az 1. és 2. ábrák az 1. referencia példában, a VII. részben nyert pILOT135-8 plazmid restrikciós térképet (a balról-jobbra felülról-lefelé irányuló csíkozással ellátott terület jelzi a szignál peptidet kódoló részt, mig a balról jobbra alulról-felfelé irányuló csíkozással ellátott terület jelzi az IL-2-t kódoló részt), illetve az említett plazmid primer szerkezetét (bázis-szekvenciáját) mutatják be. A 3. ábra mutatja a találmány szerinti nem glikozilezett humán IL-2 fehérje aminosav-szekvenciáját, ahol X jelentése Met vagy hidrogénatom. A 4. ábra mutatja be a 2. példában megadott pTF« kifejeződést közvetítő plazmid megalkotásának vázlatát. Az 5. ábra mutatja be az SDS-poliakrilamid lap gélelektroforézis eredményeit az 1. példa V. rész (1) és (2) módszerei szerint végrehajtva. A 6. ábra az 1. példa V. rész (6) módszerében említett tripszin-emésztéses peptid térkép, mig a 7. és 8. ábrák a találmány szerinti humán IL-2 fehérje hatását mutatják be a triciummal jelzett timidin beépülésre az NKC3 sejtvonalba illetve a' humán sejtvonalba, amint ez az 1. példa V. részének (7) módszerében megtalálható. A 9. ábra az NKC3 sejtvonal hosszú időtartamú tenyésztésének eredményeit mutatja az 1. példa V. részének (7) módszere szerint végrehajtva. 1. referencia-példa I. A humán IL-2-t kódoló mRNS izolálása Humán perifériás vérből készített limfocitákat inkubálunk 10% borjúembrió szérummal, 15 ng/ml 12-0-tetradekanoil-forbol-13 acetáttal (TPAj és 40 jug/ml konkanavalin A-val kiegészített RPMI 1640 tápközegben 37 °C hőmérsékleten, ezen a inódon indukálva IL-2-t. Az inkubálás 24. órája után 1 x 1010 így indukált humán limfocitát feltárunk és denaturálunk 5 mól/liter guanidin-tiocianátot, 5% merkaptoetanolt, 5p mmól/ liter Trisz-HCl puffert és 10 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldatban, Teflon homogenizálót alkalmazva, majd nátrium N-lauroil-szarkozinátot adunk hozzá 4% koncentrációig, és a keveréket homogenizálás után 6 ml 5,7 mól/literes cézium-klorid oldatra (5,7 mól/liter cézium-klorid, 1 mól/liter EDTA) rétegezzük éa centrifugáljuk Beckman SW28 rotort használva 24000 fordulat/perccel és 15 °C hőmérsékleten 48 órán át, így nyerünk egy RNS csapadékot. Ezt az RNS csapadékot 0,25%-os nátrium-N-lauroil-szarkozinátban oldjuk és etanollal kicsapjuk, 10 mg RNS-t nyerve. Nagy koncentrációjú sóoldatban , [0,5 mól/liter NaCl, 10 mmól/liter Trisz-HCl (pH 7,6), 1 mmól/liter EDTA, 0,3% SDS] ezt az RNS-t adszorbeáljuk egy oligo *(dT) cellulóz oszlopra. Az eluálás kis koncentrációjú sóoldattal [10 mmól/liter Trisz.HCl (pH 7,6), 1 mmól/liter EDTA, 0,3% 7
