200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
11 HU 200793 B SOS) 300 Mg poli (A)-1 tartalmazó mRNS-t ad. Ezt az mRNS-t a továbbiakban etanolos kicsapásnak vetjük alá, majd feloldjuk 0,2 ml oldatban [ 10 mmól/liter Trisz.HCl (pH 7,6), 2 mmól/liter EDTA, 0,3X SDS), 65 °C hőmérsékleten 2 percig kezeljük, majd 10-35% közötti szacharóz sűrűség gradiens centrifugálással (20 °C hőmérsékleten, 25000 fordulat/perccel 21 órán át, Beckman SW 28 rotort használva) 22 frakcióra frakcionáljuk. Minden egyes frakcióból egy alikvotot (részarányos adag) injektálunk Xenopus laevis oocitáiba éretlen petesejt) és az Így szintetizált fehérjékben az IL-2 aktivitást megmérjük. A 11-15 frakciókról (8S-15S ülepedési-koefficiens) úgy találjuk, hogy van IL-2 aktivitásuk. Kb. 25 Mg IL-2 mRNS-t tartalmaztak ezek a frakciók. II. Egyszálú DNS szintézise. A fentebb nyert mRNS-t és reverz transzkriptázt alkalmazva inkubólást hajtunk végre 100 m) reakcióoldatban [5 pg mRNS, 50 Mg oligo (dT), 100 egység reverz transzkriptáz, 1 mmól/liter dATP, 1 mmól/liter dCTP, 1 mmól/liter dGTP,' 1 mmól/liter dTTP, 8 mmól/liter MgCh, 50 mmól/liter KC1, 10 mmól/liter ditiotreitol, 50 mmól/liter Trisz.HCl (pH 8,3)] 42 °C hőmérsékleten 1 órán ét, ezt követi a fehérjementesítés fenollal és kezelés 0,1 n NaOH-val 70 °C hőmérsékleten 20 percen ét az RNS eltávolítása érdekében elbontással. III. Kettős szálú- DNS szintézise. Egy kettős szálú DNS-t szintetizálunk olyan módon, hogy az igy szintetizált egyszálú komplementer DNS-t 50 m1 reakcióoldatban kezeljük [a reakcióoldat a fentebb említett reakcióoldattal azonos, kivéve, hogy mRNS és oligo(dT) nincs jelen] 42 °C hőmérsékleten 2 órán át. IV. dC farok hozzáadása Ezt a kettős szálú DNS-t SÍ nukleázzal kezeljük 30 m! reakcióoldatban [kettős szálú DNS, 0,1 mól/liter nátrium-acetát (pH 4,5), 0,25 mól/liter NaCl, 1,5 mmól/liter ZnSCta, 60 egység SÍ nukleáz] szobahőmérsékleten 30 percen át, ezt követi a fehérjementesités fenollal és a DNS kicsapása etanollal. A DNS-t terminális transzferázzal kezeljük 50 m1 reakciókeverékkel [kettős szálú DNS, 0,14 mól/liter kálium-kakodilát, 0,3 mól/liter Trisz/bázis) (pH 7,6), 2 mmól/liter ditiotreitol, 1 mmól/liter COCb, 0,15 mmól/liter dCTP, 30 egység terminális transzferáz] 37 °C hőmérsékleten 3 percen át, ezáltal a kettős szálú DNS kiterjesztését idézve elő mintegy 15 dezoxicitidin egységgel mindkét 3’ végnél. Ez a reakciósor mintegy 30 ng dezoxicitidin lánc tartalmú kettős szálú DNS-t ad. V. Az Escherichia coli plazmid hasítása és dG farok hozzáadása Elkülönítve 10 Mg Escherichia coli pBR322 plazmid DNS-t kezelünk PsÜ restrikciós enzimmel 50 m1 reakcióoldatban [10 Mg DNS, 50 mmól/liter NaCl, 6 mmól/liter Trisz.HCl (pH 7,4),* 6 mmól/liter MgCk, 6 mmól/liter 2-merkaptoetanol, 100 Mg/ml borjú szérum albumin, 20 egység PstI] 37 °C hőmérsékleten 3 órán át, ezáltal elhasítva a pBR322 DNS-ben előforduló egyetlen PstI felismerő helyet, ezt követi a fehérjementesités fenollal. A hasított pBR322 plazmid DNS-t kibővitjük kb. 17 dezoxi-guanin-egységgel mindkét 3’ végén, terminális transzferázzal kezelve 50 pl reakcióoldatban [10 Mg DNS, 0,14 mól/liter kálium kakodilát, 0,3 mól/liter Trisz bázis (pH 7,6), 2 mmól/liter ditiotreitol, 1 mmól/liter C0CI2, 0,15 mmól/liter GTP, 30 egység terminális transzferáz] 37 °C hőmérsékleten 3 percen át. VI. A cDNS összeforrasztása és az Escherichia coli transzformálása. Az így nyert szintetikus kettős szálú DNS-t (0,1 Mg) és 0,5 Mg fentebb említett pBR322 plaZmidot összeforrasztunk egy 0,1 mól/liter NaCl-t, 50 mmól/liter Trisz.HCl-1 (pH 7,6) és 1 mmól/liter EDTA-t -tartalmazó oldatban melegítve 65 °C hőmérsékleten 2 percen ót, majd 45 °C hőmérsékleten 2 órán át, ezt követi a fokozatos hűtés. Ezt a terméket használjuk az Escherichia coli MM294 transzformálására Enea és munkatársainak módszerével összhangban [J. Mól. Bioi. 96, 495 (1975)]. VII. A cDNS-tartalmú plazmid izolálása Ezen az úton mintegy 20000 tetraciklinre rezisztens transzformánst izolálunk. Mindegyikük DNS-ét nitrocellulóz ' szűrőn rögzítjük. Az IL-2 Taniguchi és munkatársai által közölt [Nature, 302, 305 (1983)] aminosav-szekvenciája alapján a 74-78. aminosavaknak (Lys-His-Leu-Gln-Cys), illetve 122-126. aminosavaknak (Thr-Phe-Met-Cys-Glu) megfelelő bázisszekvenciák komplementer oligonukleotidjait (S'AAA CAT . CTT CAG TGT3’ és s' ACA TTC ATG TGT GAA3’) kémiai úton szin(tetizáljuk a foszfortriészter módszerrel [Crea, R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA,. 75, 5765 (1978)]. ' / Ezeket az oligonukleotrdokat 32P-vel jelöljük az 5’ végükömT4 polinukleotid kinázzal kezelve 50 m1 reakcióoldatban [0,20 Mg oligonukleotid, 50 mmól/liter Trisz.HCl (pH 8,0), 10 mmól/liter Mg.Ch, 10 mmól/liter 2- -merkaptoetanol, 50 mCí ü-32 P ATP, 3 egység T4 polinukleotid kináz] 37 °C hőmérsékleten 1 órán át. Ezeket a jelzett oligonukleotidokat, mint vizsgáló mintákat a fentebb említett, nitrocellulóz szűrőn rögzített DNS-ekkel összeforrasztjuk Lawn és munkatársai módszere szerint (Nucleic Acids Res. 9, 6103 (1981)]. Négy transzformánst, amely reaktiv a fenti két oligonukleotid vizsgáló mintára, észlelünk autoradiogréfiával. A plazmid DNS-t 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
