200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
tékeket egy normál valószínűségi felvételi lapon (probability paper) függvényben ábrázoljuk, és azt a hígitási tényezőt, amelynél a timidinfelvétel 50%, grafikusan meghatározzuk. Minden egyes IL-2 tartalmú mintánál ugyancsak meghatározzuk azt a hígitási faktort, amelynél a timidinfelvétel 50X, azonos módon. Azt az IL-2 aktivitás-mennyiséget, amelyet humán perifériás' vér limfociták (5 x 10® sejt/ml) 40 jug/ml konkanavalin A-val és 15 ng/ml > 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetáttal kiegészített, 10% hozzáadott FCS tartalmú RPMI 1640 tápközegben képzett szuazpenziója tenyészetének felülú szója tar•talmaz 48 órás inkubálás után 37 °C hőmérsékleten 5% COz jelenlétében, határozzuk meg 1 egység/ml-ként. A minta IL-2 koncentrációját (egység/ml) a következő képlettel számithatjuk ki: ' A minta hígitási faktora, amelynél az 50X timidin-felvótel megvalósul A standard IL-2 minta hígitási ' faktora, amelynél az 50% timidirt-felvétel megvalósul. A humán perifériás vérből nyert természetes IL-2. fajlagos aktivitása 20000-70000 egység/mg között van a fenti vizsgálati módszerrel meghatározva. Ez az aktivitás csaknem azonos a jelen tanulmány szerinti nem-glikozilezett humán IL-2 aktivitásával. A találmány szerinti nem-glikozilezett humán IL-2 fehérje előnyösen a (II) polipeptidet tartalmazza, amelynek aminosav-szekvenciája a 3. ábrában látható, ahol X jelentése Met vagy hidrogénatom. A jelen találmány szerint előállított IL-2 fehérje a következő jellemzőkkel bir: 1. ) SDS-poliakrilamid gél elektroforézisbeh homogén és molekulatömege 15000 ± 1000 dalton, az említett elektroforézíssel meghatározva; 2. ) Alanint vagy . metionint tartalmaz amino-terminális aminosavként. 3. ) Treonint tartalmaz karboxil-terminális aminosavként; 4. ) Aktivitással bir a T sejtek vagy a természetes .killer' sejtek növesztésében, miközben azok megtartják funkcióikat. A jelen találmánnyal összhangban előállított humán IL-2 fehérje negatívan reagál a limulusz lizátum vizsgálatra [Haemostasis, 7, 183, (1978)) és szennyező fehérje, valamint pirogén tartalma nagyon kicsiny, úgy, hogy ezt biztonságosan lehet alkalmazni, mint alapanyagot injekciók, stb. gyártásához. A találmánnyal összhangban nyert nem-glikozilezett humán IL-2 fehérje rendelkezik olyan aktivitással, hogy elősegíti a normál T sejtek vagy természetes .killer' sejtek növekedését, miközben azok megtartják funkcióikat. Ennélfogva a találirfány szerinti IL-2 fehérjét lehet alkalmazni T sejtek vagy természetes .killer' sejtek növesztésében és tenyésztésében in vitro hosszú időtartamon át, vagy ezek klónozásában. Sőt, ezt a tulajdonságot fel lehet használni a humán IL-2 aktivitás mérésében. Ezen kivül a találmány szerint előállított IL-2 fehérje lehetővé teszi az antigén-fajlagos' .killer' T sejtek, amelyek felismerik és elroncsolják a tumor antigéneket, Bzelektiv növesztését, vagy a természetes .killer* sejtek, amelyek képesek a tumor sejtek dőlésére, tekintet nélkül az antigén érzékenyítés tapasztalatának jelenlétére vagy távollétére, szelektív növesztését in vitro. Amikor beoltjuk az élő organizmusba szimultán az említett .killer' sejtek bevezetésével az élő organizmust, a jelen találmány szerinti humán IL-2 növeli a .killer' T sejtek antitumor hatását. Ennélfogva ezeket lehet alkalmázni tumorok megelőzéséhez vagy kezeléséhez vagy immunhiányos betegségek kezelésében melegvérű állatokban (pl. egér, patkány, nyúl, kutya, macska, sertés, ló, birka, szarvasmarha, ember). A találmány szerint előállított IL-2 fehérje nagy mértékben tisztított termék, és antigénképessége embernél kicsiny, valamint toxicitása is. Mint a tumorok megelőzéséhez és kezeléséhez szolgáló szer, a találmány szerinti humán IL-2 fehérjét vagy parenterálisan, vagy szájon keresztül lehet beadni, pl. egy ismert hordozóval megfelelő módon összekeveréssel vagy hígítással készített injekció vagy kapszula formájában. Ezt lehet használni vagy egyedül, vagy korábban említett módon in vitro növesztett .killer" T sejtekkel vagy természetes killer sejtekkel kombinálva. A találmány szerint előállított humán IL-2 fehérje lényegében azonos aktivitással bir, mint a természetes humán IL-2 és következésképpen hasonló módon lehet alkalmazni, mint az említett természetes IL-2 fehérjét. Ennek disszociációs konstansa a megfelelő sejtek IL-2 receptor helyéhez vonatkozóan igen- kicsiny, úgy, hogy nagyon kis mennyiség is elegendő a legtöbb esetben. A T sejt in vitro növesztése céljából a találmány szerinti humán IL-2-t a tápközeghez adjuk mintegy 0,01-1 egység/ml, előnyösen 0,1-0,5 egység/ml koncentrációban. A felhasználás egy példájaként T sejtek in vitro növesztése céljából, a találmány szerinti IL-2 fehérjét 0,1-0,5 egység/ml koncentrációban egy olyan sejtszuszpenzióhoz adjuk, amely pl. humán perifériás vér-eredetű T sejtek 3 napos kevert limfocita-tenyészettel (1 x 106 sejt/ml), röntgen-besugárzásból (1500 rád) származó ß-sejt transzfprmánsok (1 x 106 6ejt/ml) hozzáadásával 20% borjúembrió szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközegben nyert alloantigén-érzékenyitett T sejteket tartalmaz. A tenyésztést, mintegy 1 hónapig folytatjuk, mialatt ismételt táptalaj-cserét végzünk kb. 1 hetes intervallumokban. A kővetkező példákban érintett transzformánst, nevezetesen • az Escherichia coli 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
