200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
22 HU 200793 B (3) A kapott E. coli N4830/pTB285 transzformánst 50 ml folyékony közegbe (pH = 7,0) inokuláljuk, Mely 1 tömegX Bacto triptont (Difco Laboratories, USA), 0,5 tömegX Bacto élesztő extraktumot (Difco Labo- 5 ratories, USA), 0,5 tömegX nátrium-kloridot és 7 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmaz és 250 ml-es Erlenmeyer lombikba töltjük. Rázógépen egy éjszakán keresztül 35 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a tenyészközeget 10 5 l-es fermentorba visszük, amelyben 2,5 liter M9 közeg található, amely 0,5 tömegX kazaminosavat, 0,5 tömeg glükózt és 7 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmaz. A tenyészetet levegőztetés és kevertetés közben 4 órán 15 keresztül 35 °C hőmérsékleten és további 3 órán keresztül 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az így kapott 2,5 liter térfogatú tenyészkózegből centrifugálással összegyűjtjük a sejteket,'majd -80 °C hőmérsékletre hűtjük 20 és tároljuk. A sejteket az 1. példában leírt módon extrahálva és tisztítva nagy tisztaságú humán IL-2 fehérjét kapunk, amelynek tulajdonságai megegyeznek az 1. példa V. pontjá- 25 ban leirt tulajdonságokkal. (4) E. coli N4830/pTB285 transzformánst az 1. példa I. pontjában leirt módon tenyész21 tünk. A kapott E. coli sejteket a 91 539. számú európai közrebocsátási irat 5. példájában leirt módon extraháljuk. Közelebbről, 8 g E. coli sejtet 40 ml Tris-HCl (pH = 7,5) puff erben szuszpendált 30 mmól/1 nátrium-klorid és 20 mmól/1 Tris-HCl eleggyel mosunk, majd 0 °C hőmérsékleten 2 percen keresztül ultrahanggal kezeljük. A lizáturoot 0 °C hőmérsékleten 20 percen keresztül 1 mikrogramm/ ml lizozimmal kezeljük, háromszor megfagyasztjuk és felolvasztjuk és a kapott ‘elegyet 30 percen keresztül 28 000 g értéken centrifugáljuk. így két tétel nyers extraktumot állitunk elő, amely a táblázatban 01 tétel és 02 tétel számon szerepel. (5) E. coli N4830/pTB285 transzformánst tenyésztünk az 1. példa I. pontjában leirt módon. A kapott E. coli sejteket az 1. példa II., III. és IV. pontjában léirt módon extraháljuk és tisztítjuk. így két tétel rekombináns IL-2 (rIL-2) készítményt állítunk elő, mely a táblázatban 51 tétel és 52 tétel számon szerepel. (6) A 844678. számú finn közrebocsátási iratban megadott módon meghatározzuk a nyers extraktum "és a ' tisztított készítmény fehérjetartalmát és IL-2 aktivitását. A mérési eredményeket az 5. táblázatban adjuk meg. rIL-2 készítmény 5. TÁBLÁZAT Fehérjetartalom (mg/ml) IL-2 aktivitás (egység/ml) Nyers extraktum: Tisztított készítmény 01 tétel 02 tétel 51 tétel 52 tétel 15,4 90,0 14,0 86,5 1,08 28500 0,98 27000 (7) A kapott rIL-2 készítményeket használjuk a következő II. kísérletben. II. kísérlet II-1. kísérlet: az rIL-2 készítmények endotoxin tartalma (1) Felhasznált anyagok: Az rIL-2 készítményeket (01 és 02 tétel nyers ’ extraktum, valamint 51 és 52 tétel tisztított készítmény) a I. kísérlet szerint állítjuk elő. t (2) Vizsgálati módszerek és eredmények: A készítmények endotoxin tartalmát T. Sakata és munkatársai (J. Párén. Sei. Teck. 39, 194, 1985) módszerével határozzuk meg. Először Escherichia coli 055:B5 Control 704089 törzsből (Difco Laboratories, USA) származó standard endotoxint oldunk vízben, és Így 3,1 x 10*3 ng/ml, 6,3 x 10~3 ng/ml, 1,25 x x 10‘2 ng/ml, 2,5 x 10*2 ng/ml és 5,0 x x lO-2 ng/ral koncentrációjú endotoxin oldat sorozatot állitunk elő. A toxinoroéter ET-201 készüléken elvégzett vizsgálathoz egy 10 mm átmérőjű üvegcsőbe 100 mikroliter vizsgálandó oldatot és 100 mikroliter LAL oldatot (Li-i r mulus ambocyte lizátum egy Limúlus polyphemus vérsejt extraktum, Associates of Cape Cod, Inc.) adunk. A reakcióelegyet- Voltex keverőn néhány másodpercen keresztül kevertetjük, majd a kémcsövet a készülék opti^ kai egységébe helyezzük és a később részletezett módon mérjük a zavarosságot. A reakcióidőt minden mintánál külön számoljuk a gélesedés megkezdéséig. A mérési eredményeket a 6. táblázat tartalmazza. 55 6. TÁBLÁZAT Standard endotoxin Gélesedési idő koncentráció (ng/ml) (perc) 5,0 x ío-2 16,50 2,5 x ío-2 19,40 1,25 3 i 10-2 24,60 6,3 x 10-3 32,20 3,1 x 10-3 39,40 13
