200792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fibrinolitikus enzimek és hatóanyagként a fenti enzimeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 200792 B 1. Táblázat 10 GPK-ból származó enzim tisztítása Térfogat (ml) Összes protein (mg) Összes aktivitás (NE) Specifikus aktivitás (NE/mg) Hozam (X) Tisztítási faktor Táptalaj 5,000 1,606 57,800 36 100 1 Cink-kelét-agaróz 80 205 54,100 264 93 7,3 Konkavalin A-agaróz 72 11 38,100 3,464 66 96 Sephadex G-150 27 2 25,000 12,500 43 347 c) Enzimes vizsgálatok ií Fibrin-lemez módszer A fibrin-lemezeket az alábbi módon állítják elő. 52 mm átmérőjű polisztirol Petri-csészébe 3 ml 1 mg/ml fibrinogén-tartalmú fibrin—lemez—puff ért mérünk, és 10 pl (250 egység/ml) trombin hozzáadásával megalvasztjuk, majd szobahőmérsékleten legalább 30 percen át állni hagyjuk. A lemezre 50 /ul felülúszót, illetve 50 pl, 10 jul/l koncentrációjú plazmin standard-oldatot mérünk, majd a lemezeket 20 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A lizált terület nagyságát a derékszögű átmérők mérésével határozzuk meg, és úgynevezett plazmin-egységben adjuk meg [1 plazmin-egység (PU) az 1 ng plazmin által okozott lízis mértéke]. A meghatározásokat két párhuzamos mintával végezzük. ii) Fibrinalvadék-lízisidő módszer A GPK-ból vagy BEB-ból származó enzimek fibrinolitikus aktivitását standard urokináz oldat (emberi urokináz 1. Nemzetközi Referencia Preparátuma, alapítása 1966-ban) aktivitásával hasonlítjuk össze. A standard csőben lévő urokinázt 0,1 mól/1 nátrium-kloridot és 0,25 vegyes% zselatint tartalmazó 50 mmól/l-es nátrium-dietil-barbiturát-pufferoldatban (pH 7,8) oldjuk. A fenti pufferrel a standard urokinázból és a fibrinolitikus enzimekből is készítünk néhány hígítást. A többi reagenseket is ugyanezzel a pufferral hígítjuk, és az összekeverésig jéggel hűtjük. A különböző koncentrációjú urokináz- illetve enzimoldatokból 10 x 50 mm-es csövekbe 0,2 ml-eket mérünk. Hozzámérünk 0,05 ml 3 mg/ml koncentrációjú humán plazminogént, 0,5 ml 0,25 vegyes%-os humán fibrinogént és 0,05 ml 40 NIH egység/ml koncentrációjú trombint. A csövek tartalmát gyorsan összekeverjük és a csöveket 37,5 °C-os vízfürdőbe helyezzük. Megindítjuk a stopperórát, 20 és a csövek óvatos megdöntésével megállapítjuk a lizisidó végpontját. A lizisidó (perc) logaritmusát az alvadókban lévő urokináz koncentrációjának logaritmusával szemben ábrázolva felvesszük a kalibrációs görbét. A 25 0,5 NE/ml koncentrációjú urokináz oldattal azonos lízisidöt mutató enzimhigitás higitási faktorának figyelembevételével kiszámítjuk a higítatlan enzimoldat aktivitását. Az enzim fibrinolitikus aktivitását ennek megfelelően 30 nemzetközi egységben (NE) fejezzük ki. A GPK-ból származó tisztított enzim átlagos fajlagos aktivitása (fibrinolitikus aktivitás/mg protein) közelítőleg 12500 NE/mg. 35 dl Protein-meghatározás A proteintartalmat módosított Coomassie Blue G festékkötődési módszerrel mérjük, a Read és Northcote [Anal. Biochem. 116, 53 40 ,(1981)] által ismertetett módon. Standard proteinként marhaszérum-albumin V. frakciót használunk. e) Kontrollok 45 Az 1. példa (a) pontjában leírtak szerint eljárva, de sejtek nélkül egy sarzsból 670 mg fagyasztva szárított anyagot állítunk elő. Az anyagot fibrin-lemezen vizsgálva ne- 50 gatív eredményt kapunk. Néhány más sejtvonallal nyert tenyészet felülúszóját is megvizsgáltuk fibrinolitikus aktivitás szempontjából, de azokkal vagy negatív eredményt kaptunk vagy csak igen gyenge fibrinolitikus hatást találtunk. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. 7
