200792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fibrinolitikus enzimek és hatóanyagként a fenti enzimeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 IIU 200792 B 12 2. Táblázat Különböző sejtvonalakkal nyert felülúszók fibrinolitikus aktivitása Sejt Fibrinolitikus index i S.D. Jelölés Eredet (plazmin-egység) felülúszó sejt extraktum GPK CNCMI-222 643 + 101 787 t 69 BEB CNCMI-221 376 ± 43 n.v. HeLa humán nyak-rák 0 34 ± 8 • MRC5 humán tüdő-fibroblasztok 0 30 ± 8 Swiss 3T3 Egér belhémsejt 17 + 4 153 t 21 RLC W Patkány májsejt 56 ♦ 13 96 i 13 FCC Csimpánz májsejt 0 3 GLV 3 Zöldmajom vesehámsejt 0 n.v. SV40 3T3 Vírus-transzformált 3T3 sejtek 39 + 17 n.v. S.D. = standard deviáció n.v. = nem vizsgált f) Hőkezelés hatása (enzim inaktiválása) 25 Egy sarzs sejttenyészetből származó anyagból (GPK 37, 3. sarzs) a fagyasztva szárítás előtt két 0,5 ml-es mintát veszünk. Az egyiket forró vízfürdőn 5 percen át mele- 30 gitjük, a másikat szokásos kontrollként használjuk. A hókezelt minta fibrin-lemez vizsgálatban inaktívnak bizonyult. Fizikai-kémiai tulajdonságok 35 a) Fibrin-lemez vizsgálat A GPK-ból származó enzimoldat fibrinolitikus aktivitását plazminogént tartalmazó 40 marha fibrin-lemezen határozzuk meg. 3 ml 1 mg/ml koncentrációjú fibrinogénoldatot (ex-Sigma) 52 mm átmérőjű Petri-csészében (Gibco Europe Ltd.) 10 ul pufferben oldott 2,5 egység trombin hozzáadásával megalvasz- 45 tunk. A lemezeket felhasználás előtt szobahőmérsékleten legalább 30 percen át állni hagyjuk. A lemezre 50 ul vizsgálati mintát mérünk, majd 18 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A lizis zónáját mérjük és a 10 pg/ml 50 plazminnal kapott zóna %-ában fejezzük ki. b) A fibrin-lemezek előkezelése A fibrinréteg saját plazminogéntartalmé- 55 nak inaktiválása céljából a fibrin-lemezeket 80 °C-on 45 percen át melegítjük. A lemezeket felhasználás előtt szobahőmérsékletre hagyjuk kihűlni. Ügyelni kell arra, hogy a fibrinréteg felületén ne konderizálódjon le a 60 pára. A fenti eljárás eredményeként a szenynyeződésként jelenlévő plazminogén denaturálódik, így a lemez a plazminogénaktivátorok - például urokináz - hatásával szemben ér- 65 zéketlen lesz (és a lemez proteolízissel szembeni érzékenysége is csökken). A 4. ábrán látható a GPK-ból származó enzim fibrinolitikus aktivitása plazminnal és urokinázzal összehasonlítva, hőkezelt és nem hókezelt fibrin-lemezen. Mint az várható, urokináz esetén a hókezelt lemezen nem találunk fibrinolitikus aktivitást, mivel a szenynyeződésként jelenlévő plazminogén inaktiválódott. Ezzel szemben a GPK-ból származó enzim a hőkezelt lemezen is képes lizálni a fibrint, noha kisebb mértékben, mint a nem hókezelt lemezen. A fenti eredményekből arra következtethetünk, hogy az ismert plazminogénaktivátorokkal ellentétben, a GPK-ból származó enzim mind közvetlen fibrinolitikus aktivitással, mind plazminogénaktivátor hatással rendelkezik. A GPK-ból származó enzim fibrinolitikus aktivitását plazminogén-mentes, kereskedelemben kapható plazminogén-mentes fibrinogénből készített fibrin-lemezen vizsgálva lízist észlelünk, míg az urokináz ebben a vizsgálatban negatív, nem lizálja a fibrin-lemezt. c) Molekulatömeg-meghatározás A GPK-ból származó enzim molekulatömegét 10%-os poli(akril-amid)-gél lemezen nátrium-dodecil-szulfátos rendszerben határozzuk meg, redukáló és nem redukáló körülmények között, Laemmi U.K. és Favre M. [J. Mól. Bioi. 80, 575 (1973)1 módszere szerint. A mintákat 90 °C-on 5 percen ét melegítjük, majd elektroforetizáljuk. Összehasonlító standard anyagként foszforiláz B-t (92 500), marhaszérum-albumint (67000), ovalbumint (45000), karbonát-dihidratázt (31000), szója-tripszininhibitort (21300) és lizozimet (14400) használunk. 8
