200792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fibrinolitikus enzimek és hatóanyagként a fenti enzimeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 200792 B 8 rendesen csak sejtszuszpenziók esetén használhatnánk. A fenti módszer előnye, hogy pusztán külső szabályozással homogén tenyészetet biztosíthatunk, optimális külső körülmények között, a nagyítás mértéke nem korlátozott és a sejtek táptalajhoz viszonyított aránya könnyen változtatható a koncentráltabb termék keletkezése érdekében. A szokásosan használt mikrohordozók grammonként 5000 cm2 tenyésztófelületet biztosítanak, és a tenyésztőberendezés bonyolultságától függően 3-15 g/1 koncentrációban alkalmazhatók. A sejttenyésztés elvei minden típusú és léptékű tenyésztöedényre azonosak. 1. példa a) CPK-sejtekból mikrohordozós módszerrel előállított enzim (CDE) kinyerése A tenyésztést 10 g/1 koncentrációban alkalmazott Cytodex-3 (Pharmacia Fine Chemicals) mikrohordozóval végezzük, 5 literes, 4.5 1 hasznos térfogatú Biocul Fermenter (L.H. Fermentation Ltd.) fermentorban, melyet 2 1 táptalajt tartalmazó perfúziós tartályhoz kapcsolunk. A fenti koncentrációban alkalmazott mikrohordozókkal a felület-táptalaj arány több, mint négyszerese annak az aránynak, amelyet forgatott tenyészet esetén elérhettünk volna, a sejtek életben tartáséhoz és működéséhez viszont megfelelő Oxigénszintet, pH-t, tápanyag-koncentrációt és nagy perfúziós sebességet kell biztosítanunk. A fenti követelményeknek megfelelő tenyésztőberendezést Griffiths J.B. és Thornton B. (J. Chera.' Tech. Biotechnoi. 32 324 (1982)] ismertette. A forgó palackos tenyészetben előállított 2.5 x 109 sejtet tartalmazó inokulumot 10% FBS-sel 0,001% Tween 80-nal és Hepes-pufferral kiegészített Eagles (MEM) táptalajhoz adjuk. 72-96 órás tenyésztés után 37 °C-on a sejtek a rendelkezésükre álló szubsztrót 70%-át befedik (általában 1,4 x 1010 sejtnek felel meg). A táptalajt dekantáljuk, a sejteket és a mikrohordozót szérum-mentes táptalajjal kétszer mossuk, majd szérummentes MEM-táptalajjal feltöltjük a fermentort és 37 °C-on további 60 órán át inkubáljuk, ez alatt az idő alatt újabb sejtszaporodás és enzim-termelés figyelhető meg. Az inkubálás befejeztével a felülúszót leöntjük és a szuszpenzió formájában lévő sejtek eltávolítására 450 g-vel 10 percen át centrifugáljuk. A felülúszót ezután 40000 g-vel 5 °C-on 30 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszóból fibrin-lemezes vizsgálathoz egy 50 pl-es mintát veszünk, a többi részét fagyasztva szárítjuk, majd ismert súlyú palackba visszük és cseppfolyós nitrogéntartályban tároljuk. A felülúszót másik lehetőség szerint ultraszűréssel is koncentrálhatjuk. b) A CPK sejttenyészet felülúszójának tisztítása A tenyészetből nyert koncentrált felülúszót 1 mól/1 nátrium-kloridot és 0,01% Tween 80-at tartalmazó 0,02 mól/l-es Tris-HCl-pufferrel (pH 7,5) előzőleg 4 °C-on ekvilibrált 4,4 cm x 12 cm-es cink-kelát-agaróz oszlopon kromatografálva részlegesen tisztítjuk oly módon, hogy 5 1 fenti felülúszót 120 ml/óra sebességgel átfolyatunk az oszlopon. Az oszlopot 2 1 ekvilibráló pufferrel mossuk, majd a kötött fehérjéket 1 liter őssztérfogatú, az ekvilibráló pufferben 0- -0,05 mól/1 imidazollal kialakított lineáris grádienssel eluáljuk. Az eluátumból 8 ml-es frakciókat szedünk. A frakciók UV-abszorpcióját 280 nm hullámhosszon mérjük, és fibrinolitikus aktivitásukat fibrin-lemez módszerrel határozzuk meg. Az eredményeket az 1., ábrán szemléltetjük. Az aktiv frakciókat egyesítjük és fibrinalvadék-lízisidö módszerrel meghatározzuk a specifikus aktivitást. A következő lépésben az egyesített frakciókat 2,2 x 15 cm-es 1 mól/1 nátrium-kloridot' és 0,01% Tween 80-at tartalmazó 0,01 mól/l-es nátrium-foszfát-puffer-oldattal (pH 7,5) ekvilibrált konkavalin A-agaróz oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot ekvilibráló pufferral mossuk, 10 ml/óra átfolyási sebességgel, míg az eluátum 280 nm-nél mért UV-abszorpció-értéke 0,15 alá csökken. A kötött anyagot 200 ml ekvilibráló pufferból és 0,6 mól/1 cC-D-metil-mannozidot, 2 mól/1 kálium-rodanidot és 0,01% Tween 80-at tartalmazó 0,01 mól/l-es foszfát-pufferből (pH 7,5) kialakított lineáris gradienssel eluáljuk. Az eluátumból 5 ml-es frakciókat szedünk, és meghatározzuk az egyes frakciók 280 nm-nél mért abszorpcióját és fibrinolitikus aktivitását, a fentebb ismertetett módon. Az eredmények a 2. ábrán láthatók. Az aktív frakciókat egyesítjük és a kálium-rodanid-koncentrációt szilárd kálium-rodanid hozzáadásával 1,6 mól/l-re növeljük. Ezután az oldatot dialízissel koncentráljuk, 15000 - 20000 daltön molekulatömegű polietilénglikollal szemben. Az 5-8 ml térfogatú koncentrált oldatot centrifugáljuk, majd superfinom minőségű Sephadex G-150-nel töltött 2,5 x 90 cm-es oszlopon 1,6 mól/1 kálium-rodanidot és 0,01% Tween 80-at tartalmazó 0,01 mól/l-es foszfát-pufferoldattal (pH 7,5) gélszűrjük. 9 ml/óra átfolyási sebesség mellett 3 ml-es frakciókat szedünk. Az aktív enzim egyetlen csúcsban eluálódik, amely egybeesik egy kisebb fehérje-csúccsal (3. ábra). Az aktív enzimet tartalmazó frakciókat egyesítjük, polietilénglikollal szemben dializálva koncentráljuk és -80 °C-on tároljuk. « Másik lehetőség a konkavalin A-agaróz oszlopról nyert eluátum további tisztítására a lizin-Sepharose-on vagy fibrin-Sepharose-on végzett affinitási kromatográfiás jsljárás. A GPK-ból származó enzim tisztításának eredményeit az 1. táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
