200786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporinok előállítására
15 HU 200786 B 16 -szeres mennyiségű metanolt alkalmazunk. Ezt követően a csúcsfrakciókat kromatográfiásan tisztítjuk: ennek során 30-szoros mennyiségű Silicagel 60 típusú szilikagélt (szemcsemérete 0,04-0,063 mm) és eluálószerként vizzel telitett etil— acetátot alkalmazunk. Az eluálás során elsőként távozik a ciklosporin, ezt követi a [(D)Ser]®-ciklosporin, majd a [Thrl^ciklosporin és végül a [Thr]2-[(D)Ser]a-ciklosporin. E későbbi frakciókat további kromatográfiás tisztításnak vetjük alá: ennek során 250-szeres mennyiségű Silicagel 60 típusú szilikagélt (szemcsemérete 0,02- -0,045 mm) és eluálószerként aceton és hexán 2:1 arányú elegyét alkalmazzuk. így tiszta [ThrlMfD) -Ser]s-ciklosporint kapunk. 9. példa Az alábbi vegyületek, amelyek a 4.1.-4.3. példákban leírt vegyületek előállítása sorén kiinduló anyagokként alkalmazhatók, az 5-7. példákban leírt ciklosporinokból a 3. példában leírt eljáráshoz hasonlóan állíthatók elő: 9.1. [Dihidro-MeBmtl^CNval^KDjSerl^ciklosporin [(Illa) általános képletű vegyület, ahol X’ = -dihidro-MeBmt-, Y’ = = -Nva-, Z = -Val-, W’ = -(D)Ser-], amelyet az 5.2 példában vagy a 6. példában leírt termékből állítottunk elő, [oCb20 = -251° (c = 1,23, kloroformban) -179° (c = 1,16, metanolban), op.: 155— -157 °C. 9.2. [Dihidro-MeBmt]1-! VallM (D)Ser]8-ciklosporin [(Illa) általános képletű vegyület, ahol X’ = -dihidro-MeBmt-, Y' = = -Val-, V - -Val-, W’ = -(D)Ser-], amelyet az 5.3 példában vagy a 7. példában leírt termékből állítottunk elő, [oCjo20 = -224° (c = 1,0 kloroformban). 9.3. [Dihidro-MeBmtjMThrlMfDjSerJä-ciklosporin [(Illa) általános képletű vegyület, ahol X’ = -dihidro-MeBmt-, Y’ = = -Thr-, Z’ = -Val-, W’ = -(D)Ser-], [oCId20 = -262° (c = 0,73, kloroformban), -173° (c = 0,79, metanolban), op.: 156- -158 °C. A találmány szerinti eljárással előállított (I) képletű ciklosporinok farmakológia! hatást mutatnak, amit az alábbi vizsgáló módszerekkel igazoltunk. I. Immunszuppresszlv hatások 1.1 A lokális hemolizis in vitro vizsgálata gélállapotban [R. I. Mishell és R. W. Dutton: J. Exp. Medicine, 126, 423 (1976)]: A találmány szerinti ciklosporinok - a kezeletlen kontrolokkal összehasonlítva - a hemolízis-zónékat 0,01-10,0 jug/ml koncentrációban gátolták. 1.2. A Janossy-Greaves-féle limfocita-stimulálási vizsgálat [Clin. Exp. Immunoi., 9, 483 (1971) és 10, 525 (1972)]: A találmány szerinti vegyületek a konkanavalin-A-val stimulált dezoxiribonukleinsav-szintézist (a 3H-timidin beépülését), a sejtszaporodást és a blasztogenézist egérlépsejtek esetében - a kezeletlen kontrollokkal összehasonlítva - 0,001--10,0 jug/ml koncentrációban gátolták. 1.3. A vegyes limfocita-reakció vizsgálata [Bach és munkatársai, J. Exp. Med 136. 1430 (1972)]: E vizsgálat során limfociták (Balb/c egerek lépsetjei) reakcióját (azaz szaporodását és differenciálódását) mérjük, miközben Co-inkubálást végzünk 5 napon át besugárzott egerek (CBA ) allogén lépsejtjeivel együtt a vizsgálandó anyag jelenlétében vagy a vizsgálati anyag nélkül. A vizsgálati anyag jelenlétében mért reakciót e reakció százalékos megváltozásával fejezzük ki, a kontrollok reakcióját 10056-nak véve. A találmány szerinti vegyületek alkalmazása során 0,001-10,0 /ug/ml koncentrációban e reakció gátlását figyeltük meg. 1.4. A szervek kilökésének gátlása: F 344 fajtájú nőstény szervadó (donor) patkányok veséit Wistar-Furth fajtájú nőstény befogadó patkányokban ültettük át. A vizsgálandó anyagot 14 napig orálisan adagoltuk a befogadó patkányoknak, s ekkor a kezelést megszakítottuk. Hét nappal az átültetés után a vizsgálati állatok mindkét veséjét eltávolítottuk. Mivel ez esetben a vizsgálati állatok élete az átültetett szerv befogadásától és működésétől függ, a vizsgálandó anyag hatásosságának paramétereként a túlélési idő meghosszabbodását tekintjük, összehasonlítva olyan kontroli-állatok túlélési idejével, amelyek csak placebo-t kaptak. Azoknak az állatoknak a túlélési időtartama, amelyeknek a találmány szerinti ciklosporinokat 2,5- -10 mg/kg mennyiségben orálisan adagoltuk, 60-250 nappal volt hosszabb, mint a kezeletlen kontrollállatoké, amelyek szervkilökés következtében 9-10 napon belül valamennyien elpusztultak. 2. Gyulladáscsökkentő hatás A találmány szerinti ciklosporinok gyulladáscsökkentő hatása patkányon az adjuváns-arthritis vizsgálatával mutatható ki. E vizsgálat során adjuváns-arthritist idézünk elő Pearson és Wood mód-szerével [Arthr. Rheum., 2, 440 (1959)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
