200786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporinok előállítására
5.5. [NvalMNva^-UDJSerl^ciklosporin [(Illa) általános képletű vegyület, ahol X’ = -MeBrat-, Y’ = -Nva-, Z’ = -Nva-, W’ = -(D)Ser-], [oCJd20 = -217° (c = 1,0, kloroformban); 5 és 5.6. [Thr]2-[(D)Ser]8-ciklosporin [(Illa) általános képletű vegyület, ahol X' = = -MeBmt-, Y’ = -Thr-, Z’ = -Val-, W = -(D)Ser-], [cCJd20 = -258» (c = 10 = 0,39, kloroformban), -178° (c = 0,40, metanolban), op.: 147-152 °C. 9 HU 200786 B 6. példa 15 Az 5.2. példában leírt vegyület más módon - mikrobiológiai úton - a következőképpen állítható elő: a) Literenként 50 g maltózt, 5 g 20 (DL)-norvalint, 8 g (D)-szerint, 0,75 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g magnézium-szulfát-heptahidrátot, 0,1 g kalcium-klorid-hexahidrátot és 8 g kazein-peptont tártál- 25 mazó 10 liter táptalajt beoltunk NRRL 8044 gombatörzs konidiumait és micéliumát tartalmazó 1 liter szuszpenzióval, amelyet egy háromnapos előtenyészetból vettünk. A 30 beoltott termelő táptalajt 100 ml-es részletekben 100 darab Erlenmeyer-lombikba töltjük, amelyeket a következő 14 napon át 27 °C hőmérsékleten körrázó-gépen per- 35 cenként 180 fordulatszámmal inkubálunk. Ezután a micéliumot a tenyészfolyadéktól elválasztjuk, és Turrax-berendezésben három ízben 3 liter 90%-os metanollal aprítás és 40 keverés közben extraháljuk. Az aprított micéliumot az oldószertől vákuumszűréssel elválasztjuk, és a szűrleteket egyesítjük, majd vákuumban 40 °C hőmérsékleten ad- 45 dig pároljuk, amig az eltávozó gőzök főként csak vizet tartalmaznak. Az igy kapott keveréket négy ízben, egyenként 500 ml 1,2-diklór-etánnal extraháljuk. A szerves fá- 50 zisokat egyesítjük, és vákuumban 40 °C hőmérsékleten betöményítjük. A bepárlási maradékot 1,4 kg Sephadex LH-20 (a Pharmacia cég terméke) gélen metanollal gélszűrés- 55 nek vetjük alá, és 280 ml-es frakciókban gyűjtjük. A 9-11. frakciókat, amelyek ciklosporinkeveréket tartalmaznak, egyesítjük, és 1 kg szilikagélből készült oszlopon 60 (szemcsemérete 0,063-0,2 mm, a Merck cég gyártmánya) kromatografáljuk. Az eluálásra vízzel telített etil-acetátot alkalmazunk. és 500 ml-es frakciókat gyűjtünk. A 65 polaritással összhangban az oszlopról legelőször (a 7-9. frakciókban) az [Nva]*-ciklosporint eluáljuk, ezt követi egy [NvaJMíDlSerF-ciklosporinból és ciklosporinból álló keverék. Ez utóbbi két komponenst 280 g szilikagélből készült oszlopon (szemcsemérete 0,63-0,2 mm, a Merck cég gyártmánya) választjuk szét; az eluálásra kloroform és metanol 98:2 arányú elegyét használjuk, és 100 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A 20-30. frakciókat, amelyek nyers [NvalMíDJSerj^ciklosporint tartalmaznak, további tisztításnak vetjük alá úgy, hogy magas nyomással kromatografáljuk 260 g súlyú megfordított fázisú szilikagélből készült oszlopon (a Merck cég LiChropep RP 18 gyártmánya, szemcsemérete 0,04- -0,063 mm). Az eluálásra metanol és víz 85:15 arányú elegyét alkalmazzuk, és 25 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A 45-55. frakciók egye sítésével amorf, fehér por alakjában tiszta [Nva]2-[(D)Ser]a-ciklosporint kapunk. A fenti eljárás kivitelezéséhez szükséges előtenyészetet a következőképpen készíthetjük: b) Az eredetileg izolált NRRL 8044 törzs tenyészetéből előállított spóra- és micélium-szuszpenziót, amelyet az oltásra alkalmazunk, 21 napig 27 °C hőmérsékleten olyan agar-agar-táptalajon tenyésztjük, amely 1 liter ionmentesitett vízben 20 g malátakivonatot, 20 g agar-agart és 4 g élesztőkivonatot tartalmaz. Az ezen tenyészetből származó spórákat fiziológiás konyhasóoldatban felvesszük, és így 5 x 106 spóra/ml végkoncentrációjú keveréket kapunk. E szuszpenzió 10 ml-es térfogatát alkalmazzuk a 6a. példában megadott táptalajjal azonos tenyésztő közeg 1 liternyi térfogatának oltására, azzal az eltéréssel, hogy (D)-szerint és (DL)-norvalint nem adunk a közeghez. A tenyésztést 3 napon át 27 °C hőmérsékleten percenkénti 200 fordulattal körrázó gépen végezzük. Az így kapott tenyészetet használjuk a termelő tenyészet oltására. Az [NvalMíDJSerJ^ciklosporint fermentorban a következőképpen állíthatjuk elő: c) Az NRRL 8044 törzs ferdeagar-tenyészetéból származó körülbelül 109 spórát viszünk egy rozsdamentes acélfermentorba, amely 20 liter térfogatban az alábbi összetételű elótenyésztó-táptalajt tartalmazza: 10 7
