200786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporinok előállítására
11 HU 200786 B 12 fruktóz 75 g Amber EHC 25 g kálium-dihidrogén-foszfát 5 g kálium-klorid 2,5 g desztillált vízzel 1 literre kiegészítve (az oldat pH-értéke 5,5) Ezt megelőzően 20 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizálást végzünk. Az inkubálást előnyösen 27 °C hőmérsékleten, 16 liter/perc sebességű levegőbevezetéssel, 50 kPa túlnyomással és percenként. 200-as fordulatszámmal végezzük. Az előtenyészetet hat napig inkubáljuk, s utána az előtenyészetból 15 litert viszünk egy rozsdamentes acélfermentorba, amely 300 liter termelő táptalajt tartalmaz a kővetkező összetétellel: mai tóz 75 g Amber EHC 25 g kálium-dihidrogén-foszfát 5g kálium-klorid 2,5 g (DL)-norvalin 5 g (D)-szerin 8 g desztillált vízzel 1 literre kiegészítve (az oldat pH-értéke 5,5) Előzőleg 20 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizálást végzünk. A tenyészetet 20 °C hőmérsékleten tartjuk, percenként 120 liter levegő étvezetésével, 50 kPa túlnyomással levegőztetjük, és percenként 70-es fordulatszámmal keverjük. A habképződést szilikon-emulzió hozzáadásával gátoljuk. Tizennégy napig tartó tenyésztés után a teljes térfogat 275 liter. Ekkor a tenyészetet 10 °C-ra hűtjük, és a micéliumot Westfalia-típusú szeparátorral eltávolitjuk. A szűrletet etil-acetáttal kétszer átkeverve extraháljuk, a kivonatokat kevés vízzel mossuk, egyesitjük, és vákuumban beszárítjuk. A micéliumot metanollal elkeverve homogenizáljuk és szűrjük. Ezt az extrakciót 90%-os metanol alkalmazásával két ízben megismételjük. A metanolos kivonatokat egyesitjük, és viz hozzáadása után vákuumbam betöményítjük. A visszamaradó vizes koncentrátumot etil-acetáttal kétszer extraháljuk, a kivonatokat kevés vízzel mossuk, egyesítjük, és vákuumban betöményítjük. Az így extrahált vizes fázist még két ízben extraháljuk etíl-acetát és izopropanol 8:2 arányú elegyével. E kivonatokat egyesítjük, és vákuumban ismét bepéroljuk. A micélium és a szűrlet extrakciójából származó kivonatokat szűrjük, s ennek során eluálószerként a Sephadex LH-20 mennyiségére számítva 50-szeres mennyiségű metanolt alkalmazunk. A csúcsfrakciókat kromatográfiás úton tisztítjuk: ekkor százszoros mennyiségű Silicagel 60 típusú szilikagélt (szemcsemérete 0,04-0,63 mm) és eluálószerként vízzel telített etil-acetátot használunk. Az eluálás során elsőként az [Nva^ciklosporin távozik, ezt követi a ciklosporin és az [Nva]2-!^)-Serl^ciklosporin. E későbbi frakciókat további kromatográfiás tisztításnak vetjük alá, ennek során 140-szeres mennyiségű Silicagel 60 típusú szilikagélt (szemcsemérete 0,063- -0,20 mm) és eluálószerként kloroform és metanol 98:2 arányú elegyét alkalmazzuk. így tiszta [NvajMlDJSerl^ciklosporint kapunk. 7. példa Az 5.3. példában leírt vegyület a 6. példa a) pontjában leirt eljáráshoz hasonlóan mikrobiológiai úton is előállítható, ha a következő változtatásokat hajtjuk végre: a) A táptalajban a (DL)-norvalint 10 g (L)-valinnal helyettesítjük. A micélimunak a tenyészfolyadéktól való elválasztása után az extrakciót a következőképpen végezzük: A nyers micéliumot az oldószertől vákuumszűréssel elválasztjuk a szűrleteket egyesítjük, vizet adunk hozzá, és vákuumban 40 °C hőmérsékleten addig tőményitjük, amíg az eltávozó párlat főleg csupán vizet tartalmaz. Az így kapott keveréket három ízben egyenként 5 liter etil-acetáttal extraháljuk, a szerves fázisokat egyesítjük, és vákuumban 40 °C hőmérsékleten betöményítjük. Az igy kapott maradékot 1,4 kg Sephadex LH-20 gélen (a Pharmacia cég gyártmánya) metanollal gélszűrésnek vetjük alá. A ciklosporin-keveréket tartalmazó frakciókat egyesítjük, s ezt követően 3 kg szilikagélböl (szemcsenagysága 0,020-0,045 mm, .Grace") készített oszlopon eluálószerként vízzel telített etil-acetátot alkalmazva elválasztjuk. A polaritással összhangban az oszlopról elsőként a [Val-]2- -ciklosporin távozik, és ezt követi egy olyan keverék, amelynek a főkomponense (Vall^UDjSerl^ciklosporin. E legutóbbi fókomponenst 80 g szilikagélböl (szemcsemérete 0,020-0,0045 mm, .Grace") készült oszlopon, eluálószerként aceton és hexán 1:1 arányú elegyével kromatografáljuk. A nyers [VallMD) -Ser]a-ciklosporint tartalmazó frakciókat nagynyomású kromatográfiával tovább tisztítjuk. E célra megfordított fázisú szilikagéloszlopot (a töltet súlya 160 g, szemcsemérete 0,04-0,063 mm, LiChropep RP 18 berendezés, a Merck cég gyártmánya) és eluálószerként metanol és víz 80:20 arányú elegyét alkalmazzuk, így a tiszta [ValjZ-CíDJSerl^ciklosporint amorf, fehér por alakjában kapjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
