200786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporinok előállítására
5 HU 200786 B 6 az Így kapott tenyészfolyadékból a (Illa) képletű ciklosporint elkülönítjük, vagy f) olyan (Illa) általános képletű ciklosporinok előállítására, ahol X’ -díhidro-MeBmt- csoportot jelent, égy megfelelő (Illa) képletű ciklosporint - amelyben X’. jelentése -MeBmt- csoport - redukálunk. A d) eljárás végrehajtásához alkalmas undekapeptidek a fentebb idézett 0 056 782 számú európai szabadalmi leírásban közölt általános módszerekhez hasonló eljárásokkal állíthatók elő, igy például az ezen szabadalmi leírás la. példájában megadott szkéma szerint úgy, hogy a ciklosporinmolekula 8-tól 11-ig terjedő csoportjaiból álló peptidszekvenciát az 1-től 7-ig terjedő csoportokból álló szekvenciával kombináljuk, és közben a 2- -es és/vagy 5-ós és/vagy 8-as helyzetű csoportok szükséges helyettesítését elvégezzük. A 8-as helyzetű -(D)Ser- vagy - -(D)Thrcsoport célszerűen az oxigénatomján védőcsoportot, például tercier-butil-csoportot tartalmaz. A ciklizélást a fentebb idézett európai szabadalmi leírásban leírt speciális módszerekkel végezzük, és a ciklizálás után az O-vódőcsoportot kívánt esetben [(c) eljárás] a peptidkémia területén ismert módszer alkalmazásával lehasitjuk. Az e) eljárás végrehajtása során előnyős a Tolypocladium inf latum (Gams) gombafaj NRRL 8044 jelű törzsének az alkalmazása. E törzs egy tenyészete az Egyesült Államok Mezőgazdasági Hivatalánál (Északi Kutatási és Fejlesztési Főosztály) [United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division)], Peoria városban (Illinois, Egyesült Államok) letétbe van helyezve és a nyilvánosság számára rendelkezésre áll. E törzs egy másik tenyészete a Fermentációs Kutató Intézetben (Fermentation Research Institute), (Inage, Chiba City, Japán) FRI FERM-P No. 2796 tenyészeti sorszámmal van letétbe helyezve. E törzs alaktani jellemzőit [ezt a törzset előzőleg a Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) gombafajhoz sorolták], valamint az előállítására és az elő- és utókultúrák készítésére szolgáló módszereket az irodalomban részletesen ismertették (például az 1 491 509 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban). Az e) eljárás szerint a választott törzset - például a Tolypocladium inflatum (Gams) fajból származó törzset célszerűen mintegy két héten át az alábbi példákban leírt táptalajon, hozzáadott (D)— vagy (D,L)-szerin jelenlétében 27 °C hőmérsékleten tenyésztjük. Az aminosav-prekurzort célszerűen a táptalaj 1 liter térfogatára számítva körülbelül 1 g-tól körülbelül 15 g-ig, előnyösen körülbelül 4 g-tól körülbelül 10 g-ig terjedő mennyiségben adjuk a tenyészethez. A táptalaj célszerűen a kívánt ciklosporin 2-es helyzetű csoportjának megfelelő aminosav-prekurzort is tartalmazza, például a táptalaj 1 literére számítva körülbelül 6,0 g-tól körülbelül 10,0 g-ig terjedő, előnyösen 8,0 g mennyiségben. Az inkubációs idő letelte után az így kapott (Illa) képletű ciklosporint a tenyészfolyadékból ismert módszerekkel különítjük el, például úgy, hogy a tenyészetet micéliumra és szűrletre választjuk szét, homogenizálás után a micéliumot extraháljuk, és a sejttömeget lecentrifugáljuk. Az igy kapott nyers ciklosporint például kromatográfiás úton és/vagy átkristályosítással tisztíthatjuk. Ilyen úton a többi ciklosporin, főként a természetes ciklosporinok. eltávolithatók. Az f) eljárást például úgy hajthatjuk végre, hogy a kívánt esetben végzett eljáráslépés céljára leirt módszert alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárást az alábbi 1-4 példákban részletesen ismertetjük. 1. példa [(0-Acetil)-(D)Ser]s-ciklosporin [(I) általános képletű vegyület, ahol X = = -MeBmt-, Y = oCAbu-, Z = -Val-, Q = = -0-acetil-(D)Ser-] előállítása 47 mg [(DjSerl^ciklosporinhoz (amelyet a fentebb idézett 0 056 782 számú európai szabadalmi leírás 1. vagy 3. példájában leírt módszerrel állítunk elő) 20 mg 4-(dimetil-amino )-piridin 3 ml diklór-metánnal készült oldatát adjuk. Ezután 6,1 mg frissen desztillált acetil-klorid 1 ml diklór-metánnal készült oldatát adjuk hozzá, és az igy kapott reakcióelegyet egy órán ét szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 50 ml diklór-metánnal hígítjuk, és 30 ml vízzel kirázzuk. A szerves fázist elkülönítjük, vízmentes nátrium-szulfáttal megszárítjuk, a szárítószert szűréssel eltávolítjuk, és a szűrletet bepároljuk. A lepárlási maradékot 60 g (0,062-0,20 szemcseméretű) szilikagélen kromatograf áljuk, az eluálásra 5% metanolt tartalmazó diklór-metánt alkalmazunk, és 25 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk össze. A cím szerinti vegyületet vékonyréteg-kromatogréfia segítségével, 5% metanolt tartalmazó kloroform mint vivőfázis alkalmazásával a 4-8. frakciókból kapjuk; kitermelés; 31 mg (64%). [cCJd20 = -202 °C (c = 0,92, kloroformban). 2. példa Az 1. példában leírt eljáráshoz hasonlóan a megfelelő, nem acilezett ciklosporinokból 'kiindulva állítjuk elő az alábbi vegyületeket: 2.1. [O-benzoiMDlSerj^ciklosporin [(I) általános képletű vegyület, ahol X = = -MeBmt-, Y = -oCAbu-, Z = -Val-, Q = = -0-benzoil-(D)Ser-], [cCJd20 = -220 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
